پایان نامه با کلید واژگان رسوب گذاری، بهبود کیفیت

ترکیبات TE
غلظت
محتویات
۱۰mM
Tris-Hcl, PH:7.6
1mM
EDTA, PH:8

2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing
در هر واکنش Multiplex PCR بهتر است از lμ ۵ نمونه‌ی DNA انسانی با غلظت ng ۱۰۰-۵۰ استفاده شود. اگر‌چه حساسیت آنالیزی این روش در حد ng۵۰-۲۰ از DNA می‌باشد. روش استخراج و نگهداری DNA می‌تواند روی نتایج PCR تأثیر گذار باشد. این روش نیاز به کیت خاصی برای استخراج DNA ندارد با این وجود توجه به این مسئله که در نمونه‌ها غلظت بالایی از آلودگی با نمک وجود نداشته باشد حائز اهمیت است. در این روش نباید از خون هپارینه استفاده شود زیرا هپارین می‌تواند ممانعت کننده‌ی مرحله‌ی PCR باشد. نمونه‌ی DNA را باید در TE حل کرد. pH نمونه‌ی DNA باید بین ۸ تا ۵/۸ باشد تا از دپوریناسیون در طی مرحله‌ی حرارت دادن اولیه جلوگیری شود. بهتر است در صورتی‌که قصد نگهداری طولانی مدت نمونه‌های DNA را داشته، نمونه را در دمای C°۲۰- نگهداری کرد. اگرچه DNA پس از حل شدن در TE به شدت پایدار است اما نگهداری طولانی مدت آن در دمای C °۴ ممکن است منجر به آلودگی آن با میکروارگانیسم‌ها شود .
۲-۳-۱ رسوب گذاری با اتانول
با توجه به این مسئله که نتایج مربوط به روش STR در نهایت با یکدیگر مقایسه می‌شوند، بهتر است نمونه‌های انتخاب شده از یک نوع بافت گرفته شوند و با روش یکسانی استخراج شوند. در مواردی که از نمونه‌های DNA قدیمی یا نمونه‌هایی با کیفیت نامناسب استفاده می‌شود و یا مواقعی که غلظت DNA مورد استفاده کمتر از ng/µl۴ است، روش‌های خالص سازی DNA مانند روش رسوب گذاری با اتانول، می‌تواند سبب بهبود کیفیت نمونه‌ها و ایجاد نتایج بهتر و مطمئن‌تری شود. استفاده از روش رسوب گذاری با اتانول آلودگی‌های ناشی از یون‌ها، نمک‌ها، اتانول و… را کاهش می‌دهد. غلظت نمک (NaCl)، نباید بیشتر از mM ۶۰ باشد تا دناتوراسیون به طور کامل انجام شود. هم‌چنین غلظت EDTA نباید بیش از mM۱ باشد زیرا EDTA به منیزیوم متصل شده و مانع انجام مرحله‌ی PCR می‌گردد. ناخالصی‌های یونی مانند آهن، اتانول و فنل نیز باعث کاهش فعالیت پلی‌مراز می‌گردند.
رسوب‌گذاری با اتانول به شیوه زیر بر روی نمونه‌ها انجام گرفت.
به میزان ۱/۰ حجم اولیه‌ی نمونه‌ی DNA استات سدیم M ۳ با ۵/۴:pH به نمونه‌ها اضافه شد.
به اندازه‌ی ۳ برابر حجم (پس از افزودن سدیم استات) به نمونه‌ها اتانول سرد خالص افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دور rpm14۰۰۰ سانتریفوژ گشتند.
محلول رویی به آرامی خارج شد و به رسوب DNA نصف حجم اتانول اولیه،اتانول ۷۰ درصد افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱۵ دقیقه در دور ۱۴۰۰۰ سانتریفیوژ شدند.
محلول رویی خارج شد و پس از اینکه اتانول کاملاً تبخیر شد رسوب در مقدار مناسبی از TE حل گردید.

۲-۳-۲ تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop
از ان جایی‌که روش DNA Typing دارای دقت و حساسیت بالایی است، بنابراین نمونه‌های DNA باید دارای کیفیت مطلوبی باشند. در این مطالعه جهت تعیین غلظت نمونه‌های DNA، از دستگاه نانودراپ c۲۰۰۰ استفاده شد. حین استفاده از این دستگاه، نیازی به رقیق سازی نمونه‌های DNA نمی‌باشد. ابتدا دستگاه را با استفاده از کنترل فاقد DNA (آب مقطر یا TE) صفر نموده، سپس ۲ میکرولیتر از نمونه‌ی DNA را با استفاده از سمپلر در دستگاه قرار داده شد تا میزان جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۲۸۰/۲۶۰ و ۲۳۰/۲۶۰ اندازه‌گیری شود. به طور کلی اسید‌های نوکلئیک در طول موج ۲۶۰ نانومتر و پروتئین‌ها در طول موج ۲۸۰ نانومتر بیشترین میزان جذب نوری را دارند. از نسبت جذب نمونه در طول موج ۲۶۰ به ۲۸۰ نانومتر جهت تعیین خلوص DNA و جهت بررسی حضور دترجنت‌هایی مانند SDS، کربوهیدرات، کلروفرم و فنل از نسبت جذب در طول موج ۲۶۰ به ۲۳۰ نانومتر استفاده شد. برای داشتن نمونه‌هایی با کیفیت مطلوب، عدد حاصل از نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ باید ۸/۱ یا بیشتر باشد. میزان جذب پایین‌تر از ۷/۱ نشان دهنده‌ی آلودگی نمونه‌ها با پروتئین است.
۲-۳-۳ تهیه‌ی Working Stoke
برای انجام واکنش DNA Typing ، غلظت مناسب از نمونه‌های مورد آزمایش تهیه گردید. در این مطالعه از DNA با غلظت ng/µl70 استفاده شد.

شکل ۲-۱ تصویر دستگاه نانودراپ c2000(51)

متن کامل در سایت homatez.com

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *