— (596)

11175301399751g
00g
-636297000
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
دانشکده علوم پایه
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
رشته : زیست فناوری (بیوتکنولوژی)
گرایش : میکروبی
عنوان :
شناسایی و بررسی حضور باکتری های بی هوازی نفت زی قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع کربن ، انرژی و ازت
استاد راهنما :
دکتر میترا السادات طباطبایی
استاد مشاور :
دکتر مجید نوجوان
نگارش :
فریبا مودب
زمستان 93
چکیده
حضور وسیع باکتریهای بی‌هوازی و آرکی‌ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است. فرآیندهای آرام بی‌هوازی در زیر زمین فراوان می‌باشد که به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروکربن‌ها که در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیکه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میکروارگانیزم‌هایی که قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و کربن می‌باشند، با تولید یکسری محصولات جانبی و یا با شکستن ترکیبات هیدروکربنی سنگین کمک شایانی در رفع مشکلات موجود در صنعت نفت کرده اند.
در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده از هیدروکربن های ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با استفاده از serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB ) اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با استفاده از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.
کلمات کلیدی : نفت خام ، باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

تقدیم به
مادرم
که راز جاذبه است و اولین چراغ زندگی ام
پدرم
که شهر فاضله ی قلب من است
خواهرم و برادرانم
که حضورشان دلگرمی مرا کافیست

تقدیر و تشکر
از زحمات بی دریغ استاد راهنما سرکار خانم دکتر میترا السادات طباطبایی و راهنمایی های موثر استاد مشاور جناب آقای دکتر مجید نوجوان
فهرست مطالب
فصل اول
کلیات

1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………..2
1-2 اجزاء نفت خام……………………………………………………………………………………………………..4
1-3 اهداف کلی و جزئی………………………………………………………………………………………………7
1-4 اهمیت شناسایی و بررسی منابع نفتی………………………………………………………………………….9
1-5 فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………..10
1-6 سوالات تحقیق……………………………………………………………………………………………………11
فصل دوم
پیشینه پژوهش
2-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………13
2-2 نظریه منشاء آلی نفت………………………………………………………………………………………….15
2-3 میکروبیولوژی نفت………………………………………………………………………………………………17
2-3-1 ارتقاء کیفی…………………………………………………………………………………………………….19
2-3-2 ارتقاء کمی…………………………………………………………………………………………………….20
2-4 ارتقاء زیستی یا Bio upg–ing ……………………………………………………………………….21
2-5 تولید اولیه نفت…………………………………………………………………………………………………..21
2-5-1 تولید اسید آلی که منجر به انحلال سنگهای کربناتی و توسعه کانال ها می شود………….21
2-5-2 احیای گوگرد ونیترات در ترکیبات گچی و انیدریدی و مواد معدنی سولفاتی که نفت
به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22
2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای
مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22
2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23
2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23
2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23
2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24
2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم
روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26
3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27
3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27
3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28
3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29
3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31
3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32
3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33
3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34
3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34
3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35
3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35
3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37
3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37
3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38
3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39
فصل چهارم
نتایج
4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41
4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41
4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42
4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42
4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43
4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44
4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45
فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری
5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48
5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48
5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52
5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55
5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56
پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57
منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58
منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58
فهرست جداول
جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3
جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44
جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45
فهرست نمودار
نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

فصل اول
کلیات
مقدمه
نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرآیندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده. از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S ) و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است. در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )
(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام
عنصر حداقل درصد وزنی حداکثر درصد وزنی
کربن 2/82 1/87
هیدروژن 8/11 7 / 14
گوگرد 1/0 5/5
اکسیژن 1/0 5/4
نیتروژن 1/0 5/1
جهت مقایسه ی انواع نفت خام نمی توان از آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده ی آن استفاده کرد. بدین منظور از آزمایشات استانداردی استفاده میشود که تعیین کننده ی قیمت نفت خام خواهد بود ( 7 ).
کلمه ی نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده می شود از دو کلمه ی petra و oleum که در زبان یونانی به ترتیب به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن می باشند تشکیل شده است . منابع انرژی در طبیعت شامل نفت، زغال سنگ، انرژی هسته ای، انرژی الکتریکی و غیره می باشد. با توجه به محدودیت منابع انرژی و اهمیت صرفه جویی در مصرف و آلودگی های زیستی ناشی از ان تحقیقاتی در زمینه ی علوم مختلف جهت مصرف بهینه و کاهش آلودگی های محیط زیست انجام شده است. به مجموعه تست هایی که شناسه ی نفت خام را مشخص میکنند crude assay گفته میشود. از جمله این خواص : اندازه گیری وزن مخصوص ، گوگرد ، نمک ، آب و مواد رسوبی ، گرانروی ، نقطه ی ریزش ، محدوده ی تقطیر ، ناخالصی های فلزی و کربن باقی مانده میباشند. درجه ی API نفت خام در اکثر موارد بین10 تا 45 می باشد و به ندرت کمتر از 10 یا بالاتر از 50 میباشد.
نفت خام سنگین: با درجه API 10 الی 20
نفت خام متوسط: با درجه API 20 الی 30
نفت خام سبک: با درجه API بیش از 30
در یک دسته بندی کلی محصولات حاصل از نفت خام ایران شامل:
1-سوخت های گرمایشی
2-سوخت ماشین های درون سوز
3-حلال ها
4-روغن های روان ساز
5-مواد اولیه ی صنایع پتروشیمی و شیمیایی
6-آسفالت و قیر
نفت در دمای بالاتر از 200 درجه سانتی گراد حضور ندارد و هیدروکربن ها در این دما متلاشی می شوند. (شکسته میشوند) نفت ممکن است بوسیله ی تجزیه ی باکتریایی دگرسان شود . تجزیه ی باکتریایی سبب سنگین تر شدن و گرانروی بیشتر نفت می شود. جریان آبهای زیرزمینی و فعالیت باکتریایی باعث تشکیل نفت سنگین میشود ( 1 و 2 ).
اجزاء نفت خام
نفت خام یا پترولیوم نوعی سیال است که بصورت مجموعه ای از هیدروکربن های مختلف به اشکال مایع یا گاز در مخازن زیرزمینی وجود دارد. پترولیوم در شیمی و زمین شناسی اصطلاحا به ترکیب هیدروکربنی اطلاق میشود که توسط چاه های نفت از داخل زمین استخراج میشوند. تصویر اصلی پترولیوم در داخل مخازن به صورت گاز است که به نام گاز طبیعی نامیده میشود. بخشی از پترولیوم در شرایط متعارفی ( دمای 15 درجه سانتی گراد و فشار 760 میلی متر جیوه ) به صورت مایع درآمده که به آن نفت خام می گویند و بخش دیگر به همان صورت گاز باقی می ماند. نفت و فراورده های آن از زمان های بسیار قدیم مورد استفاده قرار گرفته است. این ماده را از قرن ها پیش به صورت گاز در آتشکده و یا به فرم قیر می شناختند بطوریکه در کتب مقدس و تاریخی اشاره شده که در ساختمان برج بابل از قیر استفاده گردیده است. کشتی نوح و گهواره ی موسی نیز به قیر اندود بوده است. علاوه بر این بابلی ها از قیر به عنوان ماده قابل احتراق در چراغ ها و تهیه ی ساروج جهت غیر قابل نفوذ نمودن سدها و بالاخره جهت استحکام جاده ها استفاده می کردند. همچنین نادر شاه با استفاده از روشن کردن مشعل های نفت موفقیت چشمگیری در فتح هندوستان بدست آورد. اولین چاه نفت در سال 1859 در یک ساختمان تاقدیسی در ایالت پنسیلوانیای آمریکا حفر گردید. در ایران هم اولین چاه نفت در سال 1902 در تاقدیس مسجد سلیمان به ثبت رسید. بیشتر تولیدات نفتی تا نیمه ی قرن نوزدهم از طریق چشمه های نفتی با گودال های کم عمق و چاه های دستی حفر شده در مخازن نفتی کم عمق صورت گرفت. حفاری های نسبتا عمیق جهت استخراج نفت در ابتدا در ناحیه ی پچل بورن فرانسه انجام شد. در این ناحیه ماسه های نفتی در زمین بطور قابل ملاحظه ای گسترده شده است. با شروع جنگ جهانی اول ( 1918_1914) نیاز به مواد نفتی به شدت افزایش یافت (5).
اجزاء تشکیل دهنده ی نفت خام را می توان بر اساس کروماتوگرافی جذب سطحی به چهار جزء اشباع شده، آروماتیک، رزین و آسفالتین تفکیک کرد. هر کدام از این 4 گروه تعداد زیادی از ترکیبات مختلف را شامل میشوند. هیدروکربن های اشباع شده ترکیباتی هستند که هیچ پیوند دوگانه ای در ساختار خود ندارند. این هیدروکربن ها را میتوان بر اساس ساختار شیمیایی به دو گروه آلکان ها ( پارافین ها ) و سیکلوآلکان ها ( نفتن ها ) تقسیم بندی کرد. آلکانها خود می توانند زنجیره های انشعاب دار یا بدون انشعاب ( نرمال ) باشند و فرمول کلی CnH2n+2 را دارند. سیکلوالکان ها دارای یک یا تعدادی حلقه کربنی ( معمولا سیکلوپنتان یا سیکلوهگزان) در ساختار خود هستند و فرمول کلی CnH2n دارند. اغلب آلکان های موجود در نفت خام دارای استخلاف آلکیل می باشند. آروماتیک ها یک یا چند حلقه آروماتیک با یا بدون استخلاف آلکیل دارند. بنزن ساده ترین آنهاست ولی در نفت خام ترکیبات آروماتیک حاوی استخلاف آلکیل عموما از انواع بدون استخلاف بیشتر هستند. بر خلاف هیدروکربن های اشباع شده و آروماتیک، آسفالتین ها و رزین ها هر دو در ساختارشان دارای گروههای قطبی غیرهیدروکربنی هستند و عناصر سازنده ی آنها علاوه بر کربن و هیدروژن شامل مقادیر ناچیزی ازت، گوگرد و یا اکسیژن نیز می باشد.
این گروهها اغلب با فلزات سنگین کمپلکس می دهند. آسفالتن ها از ترکیبات سنگین مولکولی تشکیل شده اند که در حلال هایی نظیر هپتان_n حل نمی شوند در حالیکه رزین ها مولکول های قطبی محلول در n_هپتان می باشند. رزین ها شامل ترکیبات ناجور حلقه، اسیدها و سولفونیک ها هستند. انواعی از محصولات نفتی بوسیله ی فراوری نفت خام تولید می شوند. این فرآوری اساسا یک فرآیند تقطیر جزء به جزء است که بوسیله ی آن اجزا یا بخشهای مختلف نفتی تولید می شوند. در این مطالعه آن دسته از ترکیبات اعم از خطی یا حلقوی مورد بررسی قرار میگیرند که دارای ازت به عنوان ترکیب سازنده آن می باشند ( 13 ).
( شکل1-1 ) نمونه ای از ساختمان رزین ـ آسفالتین

اهداف کلی و جزئی
اهداف کاربردی و کلی این تحقیق شامل استخراج باکتری احیاء کننده ی نیترات از نفت میباشد لذا اثر این باکتری در نفت و استفاده از آن در صنعت و تاسیسات را تحت تاثیر قرار میدهد. شناسایی باکتری های بی هوازی احیا کننده نیترات موثر در این کار بخش دیگری از این تحقیق بشمار می رود زیرا ممکن است در طی مراحل آزمایش باکتری های مقاوم به حرارتی را شناسایی کنیم که قبلا روی آنها بررسی صورت نگرفته است. به دلیل اینکه هرچه عمق مخزن بیشتر باشد حرارت افزایش می یابد و باکتری بدست آمده مقاوم تر میباشد( 8 ).
عمق اکثر مخازن نفت بین 900 تا 5000 متر است و گاهی چاه ها 7 الی 8 کیلومتر عمق دارند و اکثرا عمودی هستند. از اهداف کاربردی تحقیقات بیوتکنولوژی نفت در صنایع می توان به دسته بندی محصولات پتروشیمی که شامل محصولات اصلی مثل اتیلن ، گوگرد ، آمونیاک و… و محصولات فرعی مثل پلی کلروروینیل ( PVC ) و ملامین و در نهایت الیاف مصنوعی ، کودهای شیمیایی و غیره اشاره کرد. صنایعی که از محصولات پتروشیمی و یا تولیدات پالایشگاههای نفت به عنوان مواد اولیه استفاده می نمایند صنایع پایین دستی پتروشیمی شناخته می شوند.
صنایع پایین دستی در دو حیطه ی زیر بررسی می شوند:
-محصولات مصرفی نهایی ( End-use)
-مواد حد واسط ( مواد اولیه مورد نیاز برای تولید محصولات نهایی)
اهداف این بخش و کاربرد صنایع پایین دستی شامل: تدوین برنامه ی جامع توسعه صنایع پایین دستی پتروشیمی ، حمایت از سرمایه گذاری در صنایع پایین دستی ، آسیب شناسی صنایع پایین دستی ، تهیه و فرمولاسیون کودهای آلی ، بازیابی و تبدیل ضایعات نفتی به مواد کاربردی ، تبدیل فراورده های پتروشیمی به محصولات با ارزش ، کمک به ایجاد نهادهای مالی توسعه صنایع پایین دستی پتروشیمی (10 ).
توسعه ی فعالیت بخش خصوصی در حوزه ی پایین دستی مرتبط با نفت و پتروشیمی و ارتباط بهتر صنایع بالا دستی و پایین دستی نفت ضمن ایجاد ارزش بالاتر و اقتصاد بهتر زمینه را برای رقابت با تولیدات داخلی در بازار جهانی فراهم خواهد کرد. نتایج حاصل از این تحقیق قابل استفاده در صنایع مرتبط با صنعت نفت و محیط زیست می باشد. چنانچه در فرایندهایی مثل ازدیاد برداشت میکروبی نفت، سبکسازی نفت های سنگین، پاکسازی خاکها و آبهای آلوده به هیدروکربن های نفتی قابل استفاده است. خصوصا در کشوری مثل ایران که مبحث آلاینده های نفتی در محیط های آبی و دریاهای جنوب و شمال ایران و خاک های اطراف پالایشگاهها بررسی این موضوع مهم میباشد. در این تحقیق هدف جداسازی باکتری های بی هوازی NRB است که ازت را از ساختارهای پیچیده ی نفتی ( آسفالتین و رزین ) بیرون کشیده و آنها را به ترکیبات خطی تبدیل میکند که می تواند مورد استفاده و مصرف سایر باکتری ها قرار بگیرد.
این کار همچنین برای اهداف زیست محیطی مناسب می باشد. از جمله باعث بالا رفتن درجه API نفت خام می شود و نفت سنگین را به نفت سبک تبدیل کرده و نیز در حذف آلاینده ها و پاکسازی آلودگی های نفتی موثر می باشد ( 12 و 15 ) .
اهمیت شناسایی و بررسی منابع نفتی
نفت و سایر مواد سوختی هیدروکربنی به صورتی که ما امروزه آن را می شناسیم در مخازنی در اعماق زمین وجود دارند. این مواد در ابتدای کشف به صورت منبع بسیار مهم انرژی تلقی شدند لیکن با پیشرفت علم و تکنولوژی مدرن خواص دیگر آنها نیز مورد توجه قرار گرفت و شاید امروز بتوان گفت که ارزش مشتقات پتروشیمی بسیار حائز اهمیت می باشند زیرا منابع سوختی دیگری وجود دارند که از آنها به عنوان منبع انرژی می توان استفاده نمود. حال آنکه نفت میزانی محدود داشته و چنانچه به اتمام برسد تهیه ی مشتقات مهم آن نیز منتفی خواهد شد. لذا تولید صحیح و برنامه ریزی های دقیق در صنعت نقش بسیار مهمی را ایفا می کنند و با مرور زمان بصورت رکن اساسی این صنعت تلقی می گردند. یکی از مهمترین نیازهای بشر انرژی حاصل از سوخت های فسیلی می باشد و حدود 85 درصد انرژی از این طریق تامین می شود. غالبا انرژی حاصل از سوخت های فسیلی طی احتراق آنها آزاد شده و مورد استفاده قرار می گیرد.( 13) در حین این احتراق محصولاتی زاید ایجاد میشود که منجر به آلودگی اتمسفر و مشکلات زیست محیطی جبران ناپذیری می گردد. همانطور که در جدول 1_1 اشاره شده است از میان منابع مختلف انرژی بیشترین میزان انرژی مورد نیاز بشر از دو منبع نفت و زغال سنگ تامین می شود. آلودگی هیدروکربنی در بافت گیاهی و جانوری ممکن است موجب مرگ یا موتاسیون گردد. امروزه یکی از مشکلات بزرگ زیست محیطی ، آلودگی هیدروکربنی است. به علت استخراج نفت خام این ترکیب یک آلوده کننده ی اصلی آب و خاک در کشورهای تولید کننده ی نفت است. ایران اولین کشور غنی از نفت در خاورمیانه است که ظرفیت تولید روزانه بیش از 4 میلیون بشکه نفت خام و m3 80000 سوخت دیزلی را دارد و بیش از m3 15000000 از خاک های ایران با نفت خام آلوده هستند ( 18 و 20 ) .

(نمودار 1-1)قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری

فرضیه‏های تحقیق
نفت خام ایران با تنوع میکروبی بالا با احتمال زیاد حاوی تنوعی از باکتری های بی هوازی از جمله باکتری های بی هوازی احیاء کننده ی نیترات می باشد. این باکتری ها با حذف نیترات می توانند این باکتری ها با حذف نیترات می توانند پلی سیکلیک آروماتیک های با وزن مولکولی بالا را شکسته و یا حتی با شکستن آلکان های بلند زنجیره ، ترکیبات قابل دسترس تری برای میکروب های نفتی فراهم آورند. لذا در فرآیندهای حذف آلاینده های نفتی و یا سبکسازی نفت می توانند مثمرثمر باشند. کنترل دمایی محیط به عنوان یکی از فاکتورهای مهم در رشد و فعالیت باکتری های نفت زی می تواند در میزان حذف آلاینده ها تاثیر بگذارد. محققین رشته های مختلف علوم خاک ، محیط زیست و رفع آلودگی های محیطی ، پزوهشگاهها و پالایشگاههای نفت از این اطلاعات در چنین فرآیندهای مشابهی استفاده می کنند.
سوالات تحقیق
1-آیا در نفت ایران باکتری احیاء کننده ی نیترات وجود دارد؟
2-آیا نفت های خام مورد بررسی در این تحقیق دارای باکتری احیاء کننده ی نیترات میباشد؟
3-چالش ها و مشکلات کشت بی هوازی میکروبی چیست؟
4-آیا باکتری های احتمالی احیاء کننده ی نیترات جدا شده از نفت های مورد بررسی قابلیت ایجاد تغییر در ساختار نفت را دارند؟
5-مراحل شناسایی باکتری های جدا شده چگونه است؟
فصل دوم
پیشینه پژوهش

2-1 مقدمه
امروزه نفت یکی از مسائل اساسی دنیاست. مسائلی از قبیل عرضه و تقاضای نفت ، بهای نفت ، مواد جایگزین نفت ، باکتری های تولید کننده ، نحوه ی بهره برداری و غیره. نمونه های فراهم شده از یک بستر نفتی فعالیت قابل توجهی از باکتری مزوفیلیک احیا کننده ی نیترات و سولفات را نشان داده است. بانک میکروبی بیوتکنولوژی نفت برای اولین بار در دنیا با 150 سویه ی میکروبی توسط محققان کشورمان در پژوهشگاه صنعت نفت ایجاد شد. ایزوله کردن و توصیف صفات اختصاصی نمونه های جدید باکتری های احیاء کننده نیترات از نفت از مسائل مهم این تحقیق بشمار میرود. نفت به عنوان یک کالای تجاری با استراتژی های ملی و قدرت جهانی عجین شده است. نفت در طبقه بندی منابع خام در ردیف منابع معدنی استراتژیک است. نفت ایران سهم عظیمی در تجارت جهانی دارد بطوریکه در سال های اخیر سهم کشورمان در تجارت جهانی حدود 34 % بوده است ( 20 ) .
شهرستان های مسجد سلیمان و گچساران قسمت اعظم نفت و گاز ایران را تولید می کنند و دو مخزن بزرگ بی بی حکیمه و گچساران که در منطقه ی گچساران واقع است هر کدام چیزی حدود 32 میلیارد بشکه نفت با کیفیت دارند و تقریبا از دهه ی هفتاد این میادین وارد چرخه ی تولید نفت ایران شدند. با این حال استخراج نفت دارای مشکلاتی است و نیاز به تشخیص صلاحیت قابل اعمال دارد به این معنا که آیا محدوده ی اکتشافی استخراجی در حیطه ی صلاحیت ملی است یا صلاحیت مرجع بین المللی (سازمان ملل متحد) . در برداشت اولیه استخراج نفت بیشتر با استفاده از انرژی داخلی مخزن که توسط گازهای تحت فشار یا رانش طبیعی توسط آب ایجاد میشود صورت میگیرد. در برداشت ثانویه بیشتر از تزریق آب یا آبروبی استفاده میشود و EOR به عنوان سومین مرحله برداشت مطرح می شود. EOR مبحثی راجع به روشهای مورد استفاده برای بازیافت بیشتر نفت از مخازن نفتی است ( 14 و 18 ) .
ازدیاد بازیافت نفت ( Improved oil) و بازیافت پیشرفته ی نفت AOR (Recovery advanced oil) معانی مشابهی با EOR دارند بجز آنکه آنها روشهای مقدماتی و ثانویه برداشت را هم در بر میگیرند. چهار گروه از روشهای بازیافت حرارتی (Thermal Recovery) امتزاج گاز (Miscible gas) رانش شیمیایی (Chemical recovery) و رانش میکروبی (Flooding Microbial) وجود دارند. روشهای میکروبی عبارتند از : رانش میکروبی و بازیافت میکروبی دوره ای (Cyclic Microbial Recovery) . گاهی از امواج الکترو مغناطیس هم استفاده میشود (EMH) که در آن با ایجاد یک میدان مغناطیسی متغیر با فرکانس بالا انرژی مولکولها افزایش یافته و در نهایت از گرمای تولید شده برای ازدیاد برداشت نفت استفاده می شود. ( از چند مگا هرتز تا 300 مگا هرتز ) از این روش برای برداشت نفت های نیمه سنگین و سنگین استفاده میشود. شدت جریان به جنس مخزن بستگی دارد.
تولید نفت سنگین کانادا در آینده ی نزدیک از مرز 2/1 میلیون بشکه در روز هم می گذرد ولی در ایران با وجود ذخایر قابل ملاحظه ی نفت سنگین به دلیل عدم انتقال تکنولوژی مربوطه تولید از میادین نفت سنگین صورت نمی گیرد. یکی از روش های غیر حرارتی جهت ازدیاد برداشت از مخازن نفت سنگین روش تزریق گاز دی اکسیدکربن است. شناسایی و ارزیابی انواع آلاینده ها در محیط راهکار مناسبی برای حل مشکلات زیست محیطی صنعت نفت میباشد. از جمله اولویت های این بخش شامل:
-پایش و شبیه سازی پراکنش آلاینده ها در محیط زیست
-کنترل و پاکسازی آلاینده ها در مناطق صنعتی
-ارزیابی و جایگزینی مواد مصرفی و تولیدی در صنعت نفت در راستای کاهش پیامدهای زیست محیطی
-حذف نیترات از نفت خام و اثر آن روی صنایع مربوطه
-تحقیق در زمینه ی ردیابی آلودگی های نفتی و منشا یابی آن ها
امروزه با مصرف بسیار زیاد نفت سبک بسیاری از کشورها رو به تکنولوژی هایی جهت قابل مصرف کردن نفتهای سنگین نموده اند. یکی از متداول ترین روشهایی که امروزه مورد تحقیق و بررسی در جوامع علمی است استفاده از روش های میکروبی است. در این میان شکستن ترکیبات سنگین بسیار مورد توجه هستند، یعنی باکتریهایی که از نفت به عنوان منابع کربن ، ازت و گوگرد استفاده می کنند با بیرون کشیدن این ترکیبات از ساختارهای پیچیده ی نفتی مثل آسفالتین یا رزین باعث فروپاشیده شدن این ساختارها و سبک تر شدن نفت می گردند لذا تحقیق در زمینه ی یافتن باکتری های بومی که قادر به انجام این مهم می باشند در عرصه ی بیوتکنولوزی نفت امروزه نقش به سزایی ایفا می کند ( 16 ) .
2-2 نظریه منشاء آلی نفت
نظریه ی منشاء آلی نفت در سال 1888 توسط انگلر (Engler) و(Hofer) هوفر بیان شد. امروزه می توان گفت که نظریه ی منشا آلی برای نفت خام نسبت به هر نظریه دیگری قابل قبول تر است. نفت خام معمولا در لایهای رسوبی یافت می شود و همواره مقدار زیادی مواد آلی در این لایه ها وجود دارند. بقایای این مواد اعم از گیاهی و یا حیوانی محتوی مقدار زیادی کربن و هیدروژن هستند که سازنده ی اصلی نفت خام میباشند. بنظر می رسد موجودات بسیار کوچک و بی شماری که در دریاها ، دریاچه ها و مرداب ها زندگی می کنند و پلانکتون نامیده می شوند منشاء مواد آلی مولد نفت باشند. توزیع پلانکتون ها در سطح دریاها یکنواخت نیست. این موجودات در قسمت بالای آب دریاها ( عمق 50 تا 10 متری) که اشعه ی خورشید نفوذ می کند و نیز در مجاورت سواحل متمرکز اند. تولید مثل این موجودات بسیار زیاد است و پس از نابودی در کف دریاها رسوب کرده قسمت اعظم مواد آلی را تشکیل می دهند که بعدا با رسوب های مختلف مخلوط می شوند. همچنین آب رودخانه هایی که به دریا می ریزند حاوی مقداری مواد هیومیک است که ترکیباتشان نزدیک به هیدروکربن ها میباشد. از دیدگاه دیگر بر اساس زمان و هنگام بروز نشت نفت را به انواع زیر طبقه بندی می کنند :
1-نفت سبک و فرار :
دارای ویژگی های سیالیت زیاد و بی رنگ، سرعت پخش روی آب سریع، بوی تند و قوی و سرعت تبخیر زیاد می باشد.
2- نفت نچسب :
این نفت دارای پایه ی پارافینی متوسط تا سنگین با داشتن حالت واکسی و نچسبی می باشد و در حرارت های پایین بصورت جامد در می آید.
3- نفت سنگین و چسبناک :
غلیظ و رسوبی ، چسبناک ، معمولا بی رنگ ولی قهوه ای یا سیاه نیز می باشد و در بستر دریا ته نشین می شود و در معرض هوا بصورت قیر یا آسفالت در می آید.
4- نفت جامد :
حالت رسوبی و شبیه نفت سنگین و در حالت جامد خاصیت سمی ندارد و در حضور حرارت و گرما ذوب میشود و در مجاورت آب به صورت یک لایه جامد در می آید.
علاوه بر اثرات ذکر شده این مواد اثرات سوء اقتصادی بر انسان داشته و بدیهی است که تهدید محیط زندگی موجودات اکوسیستم ها تاثیر مستقیم بر میزان رشد این موجودات داشته و از جمعیت آنها می کاهد و ناخودآگاه انسان ها نیز از آن متاثر میشوند ( 19 ) .
2-3 میکروبیولوژی نفت
در خصوص میکروبیولوژی نفت میتوان به تحقیقات Zobell اشاره کرد، وی اولین فردی بود که به شناخت و شناسایی تاثیر میکروارگانیسم ها در اکولوژی (بوم شناختی) وضعیت نفت و محیط زیست پرداخت. وی سهم منحصر به فردی در صنعت نفت دارا میباشد. اغلب مقالات منتشر شده از وی در طی سالهای 1940و 1950 درباره ی نقش کلیدی میکروارگانیسم ها در طرز تشکیل محصولات و فراورده های هیدروکربن ها بحث میکند. وی به تهیه ی نفت خام به عنوان یک اندوخته ی تقریبا پایدار برای بهبود این صنعت فکر میکرد و نیز به بهبود بازیافت نفت و استفاده از فراورده های باکتریایی مثل اسیدها وگازها برای کمک به پویایی و تحرک فراورده های نفتی و بررسی مشکلات بدیهی و اجتناب ناپذیر آلودگی های نفتی و پتانسیل لازم برای استفاده از باکتری ها به عنوان عوامل کنترل کننده از جمله بررسی های وی بشمار میرود. شاید اگر شناخت گسترده تری از کارها و تحقیقات Zobell وجود داشت در میان دهه های این قرن واسطه های میکروبی بیشتری بازیافت نفت را بهبود می بخشیدند .
در ارتباط با میکروبیولوژی در صنعت نفت میتوان دو جنبه را مد نظر قرار داد :
1-ارتقای کمی که نمونه ی بارز آن MEOR ( Microbial Enhanced Oil Recovery )
2-ارتقای کیفی (مانند حذف هسته و اتم های گوگرد و نیتروژن)
در طبیعت چاه های نفتی وجود دارند که به علت تزریق آب دیگر قادر به تولید نفت نیستند و نیز چاههایی وجود دارند که به دلیل رسوب ترکیبات آلی و معدنی مسدود شده اند ، لذا بعد از استخراج اولیه و ثانویه نفت قسمت اعظم آن ( حدود 80 % ) در چاه ها باقی می ماند. به همین منظور روشهای مختلفی برای استخراج مابقی نفت بوجود آمده است که عبارتند از : تزریق آلیاژهای پلیمری ، روش حرارتی ، تزریق آب ، تزریق گاز ، استفاده از مواد شیمیایی کاهش دهنده ی نیروی کشش سطحی .
روش MEOR روشی است که در آن بوسیله ی میکروبهای مخصوص و مشخص میزان نفت استخراجی از چاه ها را افزایش می دهند . میکروبها به سه طریق میتوانند باعث ازدیاد برداشت از مخازن نفتی شوند :
با اکسیداسیون نفت اسید چربی تولید میکنند که باعث کاهش گرانروی نفت می گردد
با تولید مقادیر نسبی از گاز CO2 باعث افزایش فشار در مخزن شده از اینرو مانند تزریق گاز عمل میکنند
میکروبها با بوجود آوردن Bio mass میان سنگ و نفت مخزن باعث جابجایی فیزیکی نفت میشوند
شرایط فیزیکی نفت مثل دما ، فشار ، نمک و… عامل محدود کننده ی استفاده از MEOR است. در چاه های عمیق مثل کشور ما باید از میکروارگانیسم های گرمادوست استفاده شود. خصوصیات میکروبها یا باکتری های مورد استفاده : کوچک باشد- قادر به تحمل شرایط محیطی چاه باشد- رشد سریعی داشته باشد و دارای تحرک لازم و کافی داخل چاه باشد- بتواند مواد ضد میکروبی و ضد خوردگی را تحمل کند- برای رشد به مواد مغذی پیچیده نیاز نداشته باشد. انواع باکتری های مورد استفاده شامل : سودوموناس ، میکروکوکوس ، کلستریدیوم ، انتروباکتریاسه ، اشرشیاکلی ، مایکوباکتریوم ، لوکونوستوک ، باسیلوس لینکنی فرمیس .
حدود 25 % از نفت خام رها شده در آب از طریق تبخیر از بین می رود و بقیه توسط اکسایش نوری و اکسایش میکروارگانیسم ها شکسته می شود که به Bioremediation معروف است. میکروارگانیسم هایی مثل باکتری ها و قارچ ها ( اکتینومیست ها) در این عمل نقش دارند ولی در این میان سودوموناس ها اهمیت بیشتری دارند. بطور کلی میکروارگانیسم ها به کمک سه فراورده قادر به تجزیه ی هیدروکربن های نفتی می باشند: آنزیم ها – بیوسورفاکتانت- اسیدها و حلال ها ( 1 و 4 ) .
محققان کانادایی 4 پلاسمید PkT230 , PPK2033 , PHG2 , PAC25 را در سودوموناس پوتیدا قرار داده و سویه ای تولید کرده اند که قادر است همزمان نفتالین، پارافین، بنزن و آسفالتین را تجزیه کند و در واقع باعث افزایش ارتقاء کیفی نفت می گردد.
2-3-1 ارتقاء کیفی
روش های نوین در ارتقا کیفیت نفت خام و تبدیل اجزای سنگین نفت به اجزای سبک تر مانند پرتو افکنی الکترونی، اشعه گاما و اشعه ایکس؛ امروزه نسبت به روش های قدیمی تر نظیر کراکینگ گرمایی و کاتالیستی مورد توجه بیشتری قرار گرفته اند. کارهای تحقیقاتی که در این زمینه صورت گرفته است، مزایای استفاده از این روش های نوین را تایید می نمایند. کاهش تدریجی کیفیت نفت خام و قوانین محدود کننده پروتکل کیوتو مسائلی هستند که امروزه پالایشگاههای سراسر جهان با آن مواجهند. این مشکلات همراه با کاهش تقاضای بازار جهانی برای نفت کوره سنگین پالایشگاهی و همچنین رشد تقاضا برای سوختهای سبک تر و پاک تر افزایش می یابند. از سال ١٩٧۵ تا سال ٢٠٠٠ سهم بازار جهانی نفت کوره از ٣٠ % تقاضا برای محصولات پالایشگاهی به حدودا ١۵
% رسیده است. انتظار میرود این روند در طول ٢٠ سال آینده به طور پیوسته ادامه یابد و تا سال ٢٠٢٠ تا ١٠٪
دیگر هم کاهش یابد. عوامل فوق پالایشگاههای سراسر جهان را بر آن داشته است تا به دنبالراهکارهائی برای استفاده از ترکیبات سنگین پالایشگاهی به جای افزایش دادن پروسس نفت خام باشند.
یکی از بهترین روشهای ارتقاء کیفیت ترکیبات سنگین نفتی که بدلیل قابلیتهای بالای آن در رفع مشکلات و بر آورده سازی نیازهای موجود در پالایشگاهها طی سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است روش Gasification می باشد. چراکه استفاده از این روش ما را قادر می سازد علاوه بر خارج ساختن مقادیر زیادی CO امکان کاهش ترکیبات سنگین و کم ارزش از بازارهای داخلی و خارجی، میزان تولید در یک سیستم جذب آمینی نسبتا ساده را نیز داشته باشیم قابلیت استفاده ار این روش برای سوختهای با محتوای سولفور بسیار بالا و همچنین توانایی آن در کاهش دادن میزان انتشارات گلخانه ای، برتری این روش نسبت به سایر روشهای ارتقاء کیفیت را به خوبی نشان می دهد. به فر آیند تولید گازی که دارای درصد بالایی هیدروژن و مونوکسید کربن میباشد از طریق احتراق ناقص سوختها Gasification گفته می شود. تعداد بسیار زیادی از انواع هیدروکربنها میتوانند به عنوان خوراک در این فرآیند مورد استفاده قرار گیرند که عموما محصولات جانبی کم ارزش و یا ضایعات مربوط به سایر فرایند ها و ترکیبات سنگین نفتی مانند ته مانده برج خلاء ,ته Off-Gas می باشند. در ایران تحقیقات محدودی در خصوص ارتقای کیفی ترکیبات نفتی انجام شده است. از جمله راههای ارتقاء کیفیت نفت حذف ترکیبات نیتراته از هسته های هیدرو کربنی می باشد ( 7 و 22 ) .
2-3-2 ارتقاء کمی
اقتصاد ایران شامل یک بخش عمومی بزرگ است که تخمین 50 % از اقتصاد متمرکز را شامل میشود. بخش عمده ی صادرات ایران بر پایه ی صادرات نفت و گاز میباشد.(80 %) در سال 2010 این صادرات 60 درصد درآمد دولت را شامل شده است . قیمت بالای نفت در سالهای اخیر به ایران این امکان را داده است تا 97 میلیارد دلار ارز آوری داشته باشد. در کشور ایران در طی 20 سال گذشته تحقیقات درباره ی نفت افزایش پیدا کرد و بیوتکنولوژی نفت در دنیا کاملا جدید و کمتر از نیم قرن سابقه دارد .
تحقیقات زیادی روی تولید محصولات جانبی نفتی (Byproduct) به روشهای میکروبی انجام شده اما کمتر روی حذف اختصاصی یک ترکیب کار شده است. ما در این تحقیق اختصاصا روی حذف یک ترکیب خاص (ازت) از نفت خام ایران و تاثیر آن روی نفت خام و محصولات جانبی آن کار میکنیم. در 30 سال گذشته پژوهش های زیادی چه در مقیاس آزمایشگاهی و چه در مقیاس صنعتی جهت بررسی By product انجام شده اما حذف نیترات از مخازن نفت سنگین و روشهای متداول ازدیاد برداشت کار تازه ای برای تحقیقات نفتی بشمار می آید زیرا مخازن نفت سنگین و فوق سنگین به خاطر دارا بودن ویسکوزیته ی بالا دارای بازیافت قابل توجهی به صورت اولیه نمی باشند. شرایط بی هوازی در این تحقیق به دشوار بودن این عمل دلالت دارد ( 7 ) .
2-4 ارتقاء زیستی یا Bio upg–ing
امروزه فرآیند ارتقاء زیستی و تجزیه نفت در اثر حرارت به سوخت های حمل و نقل با کاتالیزورهای زیستی با فعالیت بالا مثل HDO ( hydrodeoxygenetion ) بسیار مورد توجه است. رفتار کاتالیزوری از تمام کاتالیزورها برای اولین بار در ترکیبات نفتی مورد آزمایش قرار گرفتند. برای به حداقل رساندن تشکیل ساختارهای پیچیده در ارتقاء زیستی نفت یک فرآیند دو مرحله ای مورد نیاز است. عمل تبدیل شدن به هیدروژن نشان داد که به طور عمده انحلال آلدئیدها در آب میزان الکل آنها را کاهش می دهد و علاوه بر این شکستن ترکیبات آلی نفتی در ارتقاء زیستی نفت ساختارهای پیچیده هیدروژن دار را با موفقیت به هیدروکربن های کوچک معطر تبدیل میکند که براحتی قابل ارتقاء می باشند. از این ویژگی ها در بالا بردن کیفیت نفت و سهولت تجزیه ترکیبات نفتی استفاده می شود ( 26 ) .
2-5 تولید اولیه ی نفت
2-5-1 تولید اسید آلی که منجر به انحلال سنگهای کربناتی و توسعه کانال ها می شود
تولید اسیدهایی با وزن مولکولی کم توسط میکروارگانیسم ها در حضور مواد معدنی کربوهیدراتی و در شرایط بی هوازی اثرات مختلفی در مخزن بجای می گذارند که از آن جمله افزایش نفوذپذیری خلل و فرج مخزن و همچنین تولید گاز CO2 در اثر واکنش با سنگهای کربناتی می باشد. این مکانیزم بخصوص در مورد مخازن آهکی و دولومیتی که در آنها ترکیب کلسیت، کربنات و CaMg(CO3)2 یافت می شود و اصولا جریان نفت در این مخازن با توجه به پایین بودن میزان نفوذپذیری با کندی زیادی صورت می گیرد و با توجه به اینکه نیمی از موجودی نفت دنیا در این نوع مخازن یافت می شود از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. همانطور که ذکر شد مشکل این نوع مخازن نفوذپذیری پایین آنهاست که در نتیجه حرکت نفت را بسیار کند می کند. برای رفع این مشکل یکی از راههایی که وجد دارد تزریق اسیدهای معدنی به داخل مخزن و ایجاد کانال و شکاف های مصنوعی به منظور بالا بردن نفوذپذیری می باشد که این روش با مشکلاتی از جمله مشکلات زیست محیطی و خوردگی تجهیزات همراه است. به همین دلیل تولید بیولوزیکی اسیدهای آلی بصورت درجا درون مخزن و بوسیله ی میکروارگانیسم ها که نه مشکل زیست محیطی به همراه دارد و نه مشکلاتی مانند خوردگی و غیره دارد می تواند راه حلی مناسب برای بالا بردن راندمان تولید در این نوع از مخازن باشد ( 20 و 22 ) .
2-5-2 احیاء گوگرد و نیترات در ترکیبات گچی و انیدریدی و مواد معدنی سولفاتی که نفت به دام افتاده در آنها را آزاد می کند
معدنی شدن مواد آلی گوگرد دار فرایندی است که طی آن، این مواد توسط میکروارگانیسمها، به منظور کسب انرژی تجزیه شده و گوگرد موجود در آنها به صورت سولفات آزاد می‌شود. معدنی شدن فرایندی کاملاً میکروبی است و افزودن بازدارنده‌های میکروبی باعث توقف آن می‌شود. معدنی شدن مواد آلی، یک فرایند غیراختصاصی بوده و توسط طیف وسیعی از میکروارگانیسمها (باکتریها، قارچها و اکتینومیستها) انجام می‌شود. استفاده از اسیدسولفوریک و دیگر مواد اسیدزا در خاکهای آهکی می‌تواند حلاّلیت ریزمغذیها را از طریق حذف بی‌کربنات و کاهش اسیدیته افزایش دهد. اکسیداسیون نیترات مهمترین مرحله چرخه نیترات است. زیرا در بسیاری از نفت های خام منبع اصلی ترکیبات نیترات دار هستند که نیترات موجود در آنها به شکل احیاء بوده و همچنین گوگرد موجود در بعضی از مواد اصلاح کننده به شکل احیاء است . افزودن شکلهای احیاء گوگرد به نفت موجب افزایش تعداد اکسید کننده‌ها و بالا رفتن توان اکسایش در نفت می‌شود ( 22 ) .
2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان ، دی اکسید کربن ، هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای مرده به خارج می رانند
بسیاری از گونه های باکتریایی قادر به تولید گازهای CO2- H2- N2- CH4 در شرایط مخزن می باشند که این مواد از طریق گوناگون مانند افزایش فشار مخزن ، افزایش حرکت نسبی سیالات مخزنی و کاهش گرانروی و چگالی هیدروکربن ها از طریق حل شدن در آنها و تسهیل حرکت آنها باعث ازدیاد بازیابی نفت از مخازن نفتی می گردند. یکی از اثرات تولید مواد گازی تسهیل حرکت هیذروکربن ها در اثر فرآیند جابجایی امتزاجی ( Miscible Displacement) می باشد ( 22 ) .
2-6تجزیه بیولوژیک نفت
میکروارگانیسم های تجزیه کننده ی هیدروکربن های نفتی معمولا به مقدار خیلی کم در محیط های عاری از آلودگی حضور دارند. آلودگی با هیدروکربن ها می تواند رشد چنین میکروارگانیسم هایی را تحریک کند و موجب ایجاد تغییراتی در جمعیت میکروبی در ناحیه ی آلوده شده گردد. شناسایی ارگانیسم های کلیدی که نقشی را در تجزیه زیستی آلودگی به عهده دارد برای درک ، ارزیابی و پیشرفت استراتژی های اصلاح زیستی مهم می باشد. به این دلیل تلاش های زیادی صورت گرفته تا تجزیه کنندگان مناسب شناخته شده و پتانسیل تجزیه ای این تجزیه کنندگان مشخص گردد. در واقع استفاده از میکروارگانیسم های بومی با پتانسیل شیمیایی تطبیق یافته می تواند یکی از بهترین روش ها برای اصلاح زیستی باشد. از میان جمعیت بسیار زیاد میکروارگانیسم ها در محل های آلوده شده به نفت، باکتری ها و از میان باکتری ها باسیلوس ها به دلیل داشتن اسپور و قدرت تحمل بالا می توانند نقش بسزایی در تجزیه ی بیولوژیک نفت داشته باشند ( 25 ) .
2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار می گیرند :
2-7-1 حجم نفت
طبیعتا هرچه مقدار نفت تخلیه شده در محیط دریا بیشتر باشد احتمال خطرات و خسارات وارد بر اکوسیستم بیشتر خواهد بود. در مناطق ساحلی دریاها در خصوص مقدار و حجم نفت سبک محدودیت اثر وجود دارد بطوریکه مازاد نفت توسط کشتی ها و بادها به مناطق دورتر منتقل میشود و خسارات احتمالی توسط نفت سبک به صورت سمیت نفت و تغییر در انواع اجتماعات زنده ظهور می یابد و اگر نفت غلیظ و سنگین باشد مقدار زیادی از آن در سواحل باقی مانده و گیاهان و جانوران دریایی زیر یک لایه ای از نفت دچار خفگی و کمبود اکسیژن می شوند.
2-7-2 نوع نفت
با توجه به مطالعات به عمل آمده در مورد انواع متنوعی از نفت خام، سمیت نفت های خام با یکدیگر کاملا متفاوت است. سمیت و درجه ی سمیت بطور ثابت با ویژگی های نفت تغییر نمی یابد بلکه اثرات شدید و سمیت نفت خام به وجود درصد آروماتیک ها و ترکیبات با نقطه ی جوش پایین بستگی دارد.
2-8 آلودگی های نفتی
یکی از مسائل مهم در جهان آلودگی نفتی خاک ها و آب ها است. مهمترین منابع آلوده کننده عبارتند از :
تردد شناورها و کشتی ها و تخلیه مواد زائد نفتی در دریاها
سکوهای نفتی فعال در دریاها که به امر اکتشاف و حفاری با استخراج نفت می پردازند
نشت مواد نفتی و نفت خام از خطوط لوله ی انتقال مواد نفتی در بستر دریا که اغلب به دلیل فرسودگی بیش از حد لوله ها و عدم وجود سیستم مناسب جهت تعمیر و نگهداری آنها به وقوع می پیوندند
سوانح دریایی که اغلب باعث بروز آلودگی های نفتی ناشی از نشت سوخت و بار کشتی ها به دریا میشود
آلودگی محیط در هنگام تصفیه ، ذخیره سازی و مصرف نفت
فاضلاب های صنعتی پالایشگاه ها

فصل سوم
روش کار

3-1 مقدمه
نمونه گیری به صورت کاملا بی هوازی و به روش Hungate از نفت های خام سکوی سلمان ، سکوی سروش ، سکوی نوروز و غیره گرفته شد و در ظروف استریل درپیچ دار نگهداری شد. دمای نمونه ها در زمان نمونه گیری تنظیم شد مثلا دمای نفت خام سکوی سلمان 45 درجه سانتی گراد و دمای نفت خام سکوی سروش 40 درجه می باشد. نمونه گیری توسط تکنسین متخصص پژوهشگاه صنعت نفت ایران صورت گرفت.
در روش Hungate ما نمونه ها را به ظرف های استریل درپیچ دار منتقل کرده سپس هوای داخل ظروف را کاملا با استفاده از سرنگ و تنظیم گاز خارج کرده تا محیط برای رشد باکتری های بی هوازی NRB کاملا مهیا شود. هدف از نمونه گیری بررسی حضور باکتری های احیا کننده ی نیترات در شرایط بی هوازی در نفت خام میباشد. NRB ها باکتری های بی هوازی و Fastidius بوده که در نفت خام توانایی تجزیه و مصرف نیترات را داشته و قابلیت شکستن ترکیبات پیچیده نفتی و تبدیل آنها به ترکیبات خطی و ساده را دارا می باشند که این توانایی آنها در موارد زیر می تواند موثر واقع شود :
سبک سازی نفت های سنگین
روانروی بالا
کیفیت بالای ترکیبات نفتی
مقابله با افزایش SRB
باکتری های احیا کننده نیترات در تضاد با باکتری های SRB می باشند. در شرایط ویژه محیطی در رقابت میکروبی ، باکتری های احیا کننده نیترات می توانند بر باکتری های احیا کننده سولفات غلبه نمایند. استفاده از ترکیبات پایه نیترات برای تحریک باکتری های احیا کننده نیترات در سیستم های نفتی رواج یافته است. این ترکیبات از نظر زیست محیطی هیچ خطری نداشته و به طور انتخابی باعث تحریک و افزایش جمعیت باکتری های احیا کننده نیترات می شود.
باکتری های احیا کننده سولفات ( SRB ) در برابر هوا بسیار حساس هستند و محیط زیست آنها باید کاملا عاری از اکسیژن باشد. روش آزمایشگاهی تشخیص این باکتری ها استفاده از متد استاندارد API-MethodRP38 می باشد. این باکتری ها pH خنثی را برای رشد ترجیح می دهند اما فعالیت آنها در pH 5.9-5 گزارش شده است. حرارت مناسب رشد آنها 40-20 درجه است. تغییرات محیطی ناشی از احیای سولفات اثرات و نتایج زیست محیطی و اقتصادی متعددی دارد . بیشتر رسوبات طبیعی گوگرد ناشی از فعالیت باکتری های بی هوازی SRB می باشد. فعالیت این باکتری ها در صنعت نفت باعث خوردگی خطوط لوله ، دستگاه ها ، وسایل و ماشین آلات ، مسدود شدن چاه های نفت و گاز و ترش شدن نفت می شود. لوله های فلزی به مرور زمان در اثر فعالیت این باکتری ها در شرایط بی هوازی خورده شده و در عرض چند سال سوراخ می شوند. در سال 1926 Bastin تشخیص داد که سولفوویبریو در مخازن نفت قادر به رشد و تکثیر است . نفت خام معمولا حاوی مقادیر کمی گوگرد به صورت سولفیدها- هیدروژن سولفوره و گوگرد آزاد است. هیدروژن سولفوره ها حتما بوسیله ی باکتری های احیا کننده سولفات در رسوبات حاوی نفت بوجود آمده است. تجمع این هیدروژن سولفوره ها در نفت خام باعث ترش شدن آن می گردد.
3-2 هدف کاربردی این بخش
جداسازی و بررسی حضور NRB بومی نفت خام ایران
3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده
اتوکلاو
انکوباتور
سانتریفوژ
سمپلر
ورتکس
ترازوی دیجیتال
هود لامینار
دستگاه pcR
دستگاه pH متر
یخچال
حمام بخار
چراغ مطالعه
ویال های بی هوازی
3-4 مواد مورد استفاده
محیط کشت نوترینت براث ( N.B ) ، MSM ، BSM ، نیترات براث ، BHI و BHIA ، محلول ویتامین ها و Trace mineral
اولین محیط کشت مورد استفاده محیط کشت BSM می باشد که به صورت کاملا بی هوازی آماده کردیم و به آن نفت تلقیح کردیم تا پس از یک هفته رشد باکتری های بی هوازی را در آن مشاهده کنیم. Trace element که یکی از ترکیبات محیط کشت اصلی ما می باشد و خود شامل ترکیباتی است که در قسمت پیوست 1 ذکر شده اند ، به صورت محلول تهیه شد و در تمام مراحل کشت باکتری های بی هوازی به میزان ml 1 از این محلول اضافه شد. محلول ویتامین ها نیز در شرایط کاملا استریل و زیر هود UV به صورت تازه تهیه شد و از فیلتر استریل عبور داده شد سپس در مراحل کشت باکتری ها به میزان 0.1٪ به محیط کشت اضافه شد. زیرا باکتری های بی هوازی احیا کننده نیترات پر نیاز هستند و ما با اضافه کردن محلول Trace و ویتامین ها محیط رشد این باکتری ها را کمی غنی تر می کنیم.
در مرحله بعد از محیط کشت نوترینت براث استفاده میکنیم و پس از تزریق نفت به محیط به مدت 5 الی 7 روز در دمای 40 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و پس از مشاهده رشد باکتری ها می توانیم از این محیط به محیط کشت BSM که قبلا تهیه کرده بودیم تلقیح نموده و نتیجه را مشاهده نماییم. از هفته ی ششم به بعد ما محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی میباشد و برای رشد باکتری های بی هوازی مناسب است تهیه کردیم و به آن ترکیب KNO3 نیز اضافه کردیم تا محیط کشت کمی اختصاصی تر عمل کند زیرا KNO3 خود در یک مرحله باعث جدا شدن احیا کننده های نیترات از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده خواهد شد. استفاده از محیط های کشت اختصاصی تر مثل نیترات براث و محیط کشت غنی شده BHI رشد و جداسازی باکتری های بی هوازی NRB را تسهیل کرد. با استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث و تغییر رنگ محیط کشت ما از وجود باکتری های احیا کننده نیترات در محیط مطمئن شدیم و برای جلوگیری از رشد احیا کننده های سولفات ( SRB ) در محیط مقدار KNO3 اضافه شده را افزایش دادیم و همچنین از محیط کشت بسیار غنی BHI استفاده نمودیم. در همه مراحل کشت به میزان 0.1٪ گلوکز هم به محیط اضافه کردیم.
3-5 روش کار
اولین مرحله در این تحقیق پس از مطالعه ی منابع مربوطه و داشتن اطلاعات کافی ، نمونه برداری می باشد که بر حسب موضوع تحقیق می توان از حوضچه ها ، چاه های نفت و یا مخازن پالایشگاه ها استفاده کرد. نحوه ی نمونه برداری به وسیله ی استفاده از ظروف شیشه ای با درپوش مناسب استریل میباشد. نمونه ها درون ظروف شیشه ای درپوش دار استریل معمولا توسط هلی کوپتر به آزمایشگاه منتقل می شوند و تا زمان ایزوله کردن باکتری ها، در یخچال 4- درجه نگهداری می شوند.
زمان نمونه گیری دما و بافت نمونه ها بررسی شده است. نمونه ها از سکوهای نفتی سلمان ، سروش ، بلال ، R1 و R4 در منطقه لاوان در استان خوزستان گرفته شده اند و شرایط هر نمونه به صورت زیر گزارش شده است:
نفت سکوی سلمان : دما 40-24 درجه ، بافت نمونه سبک و رقیق
نفت سکوی سروش : 65 درجه ، بافت نمونه بسیار سنگین و غلیظ
نفت سکوی بلال : دما 60 درجه ، بافت نمونه سبک
نفت سکوهای R1 و R4 : دما به ترتیب 55 درجه و 56.2 درجه ، بافت نمونه بسیار سبک
شکل ( 3-1 ) سکوی نفتی سلمان واقع در منطقه لاوان

نفت خام مورد استفاده در این تحقیق از نوع نفت خام بومی ایران می باشد. پس از نمونه گیری یک مرحله غنی سازی باکتری هایی که از نفت خام به عنوان تنها منبع کربن و انرژی استفاده می کنند صورت می گیرد. سپس بعد از مدت زمان مقرر باکتری ها جداسازی می شوند. در حالت غربالگری سویه ها از نظر توانایی رشد روی نفت خام که تنها از ازت به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده میکند مورد آنالیز قرار می گیرند.
شکل ( 3-2 ) سکوهای نفتی جزیره لاوان در استان خوزستان

3-5-1 مرحله اول
در ابتدای کار قبل از تهیه ی محیط کشت وسایل مورد نیاز را کاملا تمیز و در طی 4 مرحله ( آب و شوینده-آب مقطر-الکل و استون ) میشوریم. سپس محلول Trace element را تهیه میکنیم که یکی از ترکیبات محیط کشت اصلی ما ( BSM ) می باشد. پس از ترکیب شدن کامل مواد pH محلول را به 7 میرسانیم. (با استفاده از KoH ) از این محلول Trace element تهیه شده به میزان ml 1 به محیط کشت اصلی اضافه می شود. در مرحله ی بعدی محلول ویتامین ها را آماده میکنیم . باید توجه شود که محلول ویتامین ها باید تازه تهیه و مصرف شوند. ( زیر هود و در شرایط استریل )
پس از وزن کردن دقیق ترکیبات گفته شده به میزان معین توسط ترازوی دیجیتال میزان ml 1000 آب مقطر به آنها اضافه کرده سپس محلول به دست امده را توسط سرنگ زیر هود از فیلتر استریل عبور میدهیم که در نهایت یک محلول شفاف و بی رنگ از ویتامین ها به صورت تازه خواهیم داشت. (محلول ویتامین نیاز به اتوکلاو کردن ندارد). مرحله آخر تهیه ی محیط کشت اصلی می باشد .
همگی این ترکیبات در ml 1000 آب مقطر حل شده سپس ml 1 از محلول Trace element و ml 1 از محلول ویتامین ها و در آخر به میزان ml 1 رزازورین ( نشانگر ) به محیط کشت اضافه میکنیم.
pH محیط کشت BSM را به 7.2 می رسانیم. محلول محیط کشت را در شیشه یا ویال های کوچک بی هوازی وارد میکنیم و پس از بستن و محکم کردن درپوش آلومینیومی سر ویال ها با سرنگ هوای موجود در شیشه ها را کاملا خارج میکنیم. ( می توان محلول را روی هیتر یا شعله ی مستقیم حرارت داد تا بجوشد و اکسیژن محلول در آن خارج شود ). سپس به محلول گاز ازت ( N2 ) وارد میکنیم و پس از اطمینان از عدم حضور اکسیژن ویال ها را در اتوکلاو قرار داده ( دمای 120 درجه ) تا استریل شوند. اکنون محیط کشت ما برای تلقیح باکتری های نفتی که از مخازن نفتی منطقه ی لاوان بدست می آیند آماده است.
3-5-2 مرحله دوم
روش تلقیح و کشت باکتری
برای کشت باکتری ها هم میتوان زیر هود شیمیایی کار کرد هم میتوان با استریل کردن سکوی کار ( شعله پاشی ) و روشن کردن دو شعله بین دو شعله کار کرد. به تعداد 20 ویال از محیط کشت BSM داریم که در ابتدا برای کشت از نفت سکوی سروش استفاده کردیم و با سرنگ 2 یا 2.5 به میزان کمتر از ml 1 نفت خام به محیط کشت تزریق میکنیم. ( بدون وارد شدن هوا )
به همین ترتیب از حدودا 9 نفت خام از سکوهای مختلف نوروز-سلمان-سروش و … استفاده کردیم و به محیط کشت تزریق کردیم. سپس نمونه ها را بر طبق مقالات مطالعه شده در دمای 40 درجه و به مدت 5 روز در انکوباتور معمولی قرار میدهیم . پس از مدت طی شده نمونه ها بررسی شدند و مشاهده شد باکتری ها کاملا رشد کرده اندو در محلول کاملا حالت امولسیون را ایجاد مینمایند. که در اینصورت میتوان از آنها لام تهیه کرد و باکتری را مشاهده کرد. پس از این مرحله باید بتوانیم باکتری خود را شناسایی کنیم زیرا در محیط کشت ما همه ی باکتری های بی هوازی در حال رشد می باشند و ما باید باکتری بی هوازی نفت خوار خود را شناسایی کنیم. در هفته ی سوم از مراحل پژوهش ما تعدادی محیط کشت BSM دیگر ساخته (مطابق روشهای قبل) و در نهایت کشت نفت را انجام دادیم. در مرحله ی بعد به تعداد 4 ویال ml 50 را آماده کرده و کاملا میشوریم سپس محیط کشت نوترینت براث آماده میکنیم.(در حجم ml 250 ) . روی میزان معینی که وزن کردیم ( 13 گرم) میزان 250 میلی لیتر اب مقطر اضافه میکنیم سپس ارلن را روی حرارت قرار میدهیم و با همزن آن را کاملا یکدست و شفاف میکنیم و محلول را در ویال های ml 50 آماده شده ریخته و درپوش آلومینیومی آن را با کریمپر کاملا میبندیم و با سرنگ هوای داخل آن را خارج میکنیم سپس گاز ازت را توسط روش 2 سرنگ داخل محیط نوترینت براث پرچ میکنیم تا هوا و اکسیژن محلول در مایع کاملا خارج شود. (ابتدا سرنگ را کامل در محلول فرو برده و گاز N2 میزنیم و بعد از آن در قسمت بالایی ویال که خالی از محلول می باشد هم همین کار را تکرار میکنیم پس از اتمام کار ابتدا سرنگ هوادهی را خارج میکنیم و چند ثانیه بعد هم سرنگ متصل به کپسول گاز را خارج میکنیم تا کاملا اکسیژن موجود در محیط کشت خارج شود و شرایط بی هوازی ایجاد شود).
سپس ویال های آماده شده را بمدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه اتوکلاو کرده تا استریل شوند و اماده ی کشت و تلقیح نفت خام باشند. بعد از کشت نفت ( ml 0.1 ) به محیط نوترینت براث و قرار دادن در انکوباتور به مدت 3 الی 5 روز در دمای 40 درجه و رشد کامل باکتری ها میتوانیم از این محلول به محیط کشت BSM که قبلا تهیه کرده بودیم تزریق کنیم تا رشد باکتری های آن را مشاهده کنیم. این کار در اصل غنی سازی باکتری های نفتی ما میباشد. (کشت 1% (محیط کشت نوترینت براث که در انکوباتور قرار داده شد و باکتری ها در آن رشد کردند اکنون برای تهیه ی لام آماده است. 6 ویال ml 50 دیگر محیط کشت BSM آماده کرده و پس از وارد کردن گاز نیتروژن به انها مقداری نفت استریل یا کوئینولین به عنوان منبع کربن به آنها اضافه می گردد.( به میزان ml0.1 یا یک خط از سرنگ انسولین ). اگر از نفت به عنوان منبع کربن استفاده کردیم باید پس از تزریق به محیط کشت آن را در اتوکلاو 122 درجه استریل کنیم. پس از انجام این مراحل از محیط کشت NB که قبلا در آن کشت داده بودیم به داخل این محیط BSM که دارای نفت استریل به عنوان منبع کربن می باشد در شرایط استریل (زیر هود) تزریق میکنیم و در انکوباتور 40 درجه به مدت 5 روز قرار میدهیم تا در شرایط بی هوازی باکتری ها در آن رشد کنند.
3-5-3 مرحله سوم
روش رنگ آمیزی منفی
1 قطره از نمونه را گوشه ی لام ریخته و 1 قطره رنگ مرکب چین روی آن می ریزیم و پس از 5 دقیقه یک لام دیگر را به صورت شیب دار روی لام اصلی تا انتهای آن می کشیم و اصطلاحا گسترش تهیه می کنیم و پس از خشک شدن زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم . علت استفاده از این روش رنگ آمیزی مشاهده ی آرکی باکتر ها در صورت وجود می باشد.
3-5-4 مرحله چهارم
روش رنگ آمیزی گرم
1 قطره کریستال ویوله – به مدت 1 دقیقه – شستشو با آب مقطر
1 قطره لوگل – به مدت 1 دقیقه – شستشو با آب مقطر
الکل استون ترکیب شده – شستشو با آب مقطر
سافرانین – به مدت 20 ثانیه – شستشو با آب مقطز
3-5-5 مرحله پنجم
شروع غربالگری پس از هفته ی هشتم
در این مرحله پس از غنی سازی نمونه ها وارد مرحله ی شناسایی و جداسازی خواهیم شد. برای شناسایی نمونه های جدا شده باید از



قیمت: 10000 تومان

متن کامل در سایت homatez.com

NameEmailWebsite

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *