— (597)

289687-1905
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
رشته : زیست شناسی
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس
استاد راهنما:
دکتر خسرو خواجه
استاد مشاور:
دکتر صادق حسن نیا
نگارش:
الهام حسنی
تابستان 1392
چکیده
پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند. سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. این آنزیم یک متالوپروتئاز حاوی روی است و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و جرم مولکولی50632 دالتون می باشد و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید می باشد.
در این مطالعه ابتدا جداسازی سراشیا مارسسنس مولد آنزیم سراپپتیداز صورت گرفت و توالی ژن سراپپتیداز از بانک ژنی NCBI بدست آمد و طراحی پرایمر صورت گرفت. پس از استخراج DNA ژنومی باکتری سراشیا مارسسنس به روشBoiling ، به عنوان الگو در تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفت و پس از تایید محصول PCR، ژن تکثیر یافته در وکتور TA کلون و سپس درون وکتور بیانی PET28 ساب کلون گردید .کلون انجام شده توسط برش آنزیمی، PCRو تعیین توالی تایید شد و پلاسمید نوترکیب با آنزیم Nde1 و Xho1 خطی شده وE.coli سویه BL21 توسط وکتور نوترکیب ترانسفورم و بیان پروتئین تحت القایIPTG و الکتروفورزSDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از ستون کروماتوگرافی نیکل-سفارز آنزیم مورد نظر تخلیص گردید.
آنزيم داراي pH بهينه 7 و دماي بهينه 55 درجه است. با رسم نمودار Michaelis-Menten محاسبه Km و Vmax صورت گرفت. مقادير km و Vmax براي سوبستراي کازئین به ترتيب mM 04/0 و((mM/min 177/0 مي باشد.
کلونینگ، بیان و تخلیص و تعیین ساختار ژن سرپپتیداز در این مطالعه تایید می شود. این پروتئین نوترکیب می تواند در مطالعات آینده در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
كلمات كليدي:
پروتئاز، سراپپتيداز، كلونينگ، بيان، تخليص، فعاليت، پايداري ، سراشيا مارسسنس
تقدیم به
پدر و مادر عزیز و مهربانم که در سختی ها و دشواری های زندگی همواره یاوری دلسوز و فداکار و پشتیبانی محکم و مطمئن برایم بوده اند…
سپاس و ستایش خدای عزوجل که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درخشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید.
در اینجا وظیفه خود می دانم از زحمات بی دریغ استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر خواجه به سبب راهنمایی ها و کمک های ارزنده شان در به انجام رسانیدن این پایان نامه و نیز امکاناتی که در اختیارم قرار دادند، تشکر فراوان نمایم.
از جناب آقای دکترحسن نیا که مشاوره این پایان نامه را به عهده داشتند، سپاسگذارم.
از سرکار خانم دکتر دبیرمنش و بویژه سرکار خانم دکتر اکبری به دلیل یاری ها و راهنمایی های بی چشمداشت شان نهایت تشکر را دارم و از یکایک دوستانم در آزمایشگاه بیوشیمی دانشگاه تربیت مدرس که در طول این پایان نامه مرا یاری کردند، سپاسگذارم. از آقای دکتر نژاد ستاری رئیس محترم دانشکده علوم پایه ), واحد علوم تحقیقات تهران) که داوری این پایان نامه را پذیرفتند و در جلسه دفاع حاضر شدند متشکرم.
فهرست مطالب
عنوان شماره صفحه
چکیده
TOC o “1-3” h z u فصل اول : کلیات
1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………. 2
1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق………………………………………………………………….5
1-2-1 آنزیم ها5
1-2-2 غربالگري screeningآنزيم ها واهميت آن6
1-2-3 منابع آنزيمي7
1-2-3-1 ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين منابع آنزيمي7
1-2-3-2 موقعيت تاکسونوميک توليد کننده هاي شناخته شده آنزيمي8
1-2-3-3 ميکروارگانيسم هايGRAS8
1-2-4 کلکسيونهاي ميکروب (Culture Collection)به عنوان منابع ميکروارگانيسم ها9
1-2- 5 بازار جهانی آنزیم10
1-2-6 پروتئازها11
1-2-6-1 اعمال پروتئازها12
1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها17
1-2-7 کاربرد پروتئازها22
1-2-7-1 صنعت شوینده22
1-2-7-2 صنعت چرم23
1-2-7-3 صنایع دارویی24
1-2-7-4 صنایع غذایی25
1-2-8 سراشیا مارسسنس26
1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن28
1-2-10 روشهاي DNA نوترکيب و اهميت آن29
1-2-11 انتخاب ميزبان بيان ژن30
1-2- 12راهبردهاي نسخه برداري (انتخاب حاملين بيان ژن)31
1-2-13 سيستم بيانpET32
1-2-14استراتژي خالص سازي محصول نوترکيب34
هدف از انجام پروژه36
فصل دوم: پیشینه پژوهش
2-1 ادبیات و سوابق مربوطه………………………………………………………………………………39
فصل سوم: روش شناسی
3-1مواد شيميايي42
3-2 ميكروارگانيسم ها ومحيط هاي كشت مورد استفاده43
3-2-1 ميكروارگانيسم ها و پلاسميدها43
3-2-2محيط هاي كشت ميكروبي44
3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز45
3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسي46
3-4-1 اثر دما بر پايداري آنزيم46
3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم46
3-4-3 دماي بهينه47
3-4-4 تعيين پارامترهاي سينتيكي آنزيم47
3-5 جداسازي باکتري48
3-5-1 استخراج DNAژنومي48
3-5-2 طراحی پرايمر و انجام PCR48
3-5-2-1 مراحل PCR ……………………………………………………………………………..49
3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A 50
3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک51
3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز51
3-6 روشهای الکتروفورزی53
3-6-1 SDS-PAGE53
3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100)53
3-7 فنون مربوط به DNA نوتركيب54
3-7-1 ساختار ناقل كلونينگ54
3-7-2 آماده سازي قطعهDNA براي انتقال به درون وكتور55
3-7-3 استخراج DNA از روي ژل56
3-7- 4 مراحل کلون مجدد56
3-7-5 مستعدکردن باکتري DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)58
3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتري مستعدDH5α 59
3-8 بافرCracking60
3- 9بيان ژن سراپپتیداز و تعيين خلوص آن توسطSDS-PAGE 62
3-9-1 القاء باکتري و بيان پروتئين هاي نوترکيب62
3-9-2 بررسي بيان پروتئين هاي نوترکيب با استفاده از روش الکتروفورز63
3-10 تخليص پروتئين هاي نوترکيب66
3-10-1 بافرهاي موردنياز تخليص پروتئين نوترکيب66
3-10-2 روش تخليص پروتئين نوترکيب67
فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها4-1 جداسازي باکتري70
4-2 استخراج DNAژنومي70
4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی70
4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بيانيpET28-a (+)71
4-5 بيان و تخليص ژن سراپپتیداز نوترکيب75
4-6 منحني استاندارد77
4-7 اثر pH روي فعاليت آنزيم77
4-8 دماي بهينه آنزيم78
4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……………………………………………………………….79
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1 نتیجه گیری نهایی88
5-2 پیشنهادات88
منابع و مأخذ89
فهرست منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………..89

فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43
جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال
عنوان شماره صفحه
شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34
شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55
شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71
شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72
شکل 4-3 الکتروفورز پلاسميد هاي استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73
شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74
شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75
شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77
نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78
نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79
نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80
فصل اولکلیات مقدمهپروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک

متن کامل در سایت homatez.com

About: admin


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *