— (597)

289687-1905
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
رشته : زیست شناسی
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس
استاد راهنما:
دکتر خسرو خواجه
استاد مشاور:
دکتر صادق حسن نیا
نگارش:
الهام حسنی
تابستان 1392
چکیده
پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند. سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. این آنزیم یک متالوپروتئاز حاوی روی است و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و جرم مولکولی50632 دالتون می باشد و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید می باشد.
در این مطالعه ابتدا جداسازی سراشیا مارسسنس مولد آنزیم سراپپتیداز صورت گرفت و توالی ژن سراپپتیداز از بانک ژنی NCBI بدست آمد و طراحی پرایمر صورت گرفت. پس از استخراج DNA ژنومی باکتری سراشیا مارسسنس به روشBoiling ، به عنوان الگو در تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفت و پس از تایید محصول PCR، ژن تکثیر یافته در وکتور TA کلون و سپس درون وکتور بیانی PET28 ساب کلون گردید .کلون انجام شده توسط برش آنزیمی، PCRو تعیین توالی تایید شد و پلاسمید نوترکیب با آنزیم Nde1 و Xho1 خطی شده وE.coli سویه BL21 توسط وکتور نوترکیب ترانسفورم و بیان پروتئین تحت القایIPTG و الکتروفورزSDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از ستون کروماتوگرافی نیکل-سفارز آنزیم مورد نظر تخلیص گردید.
آنزیم دارای pH بهینه 7 و دمای بهینه 55 درجه است. با رسم نمودار Michaelis-Menten محاسبه Km و Vmax صورت گرفت. مقادیر km و Vmax برای سوبسترای کازئین به ترتیب mM 04/0 و((mM/min 177/0 می باشد.
کلونینگ، بیان و تخلیص و تعیین ساختار ژن سرپپتیداز در این مطالعه تایید می شود. این پروتئین نوترکیب می تواند در مطالعات آینده در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی:
پروتئاز، سراپپتیداز، کلونینگ، بیان، تخلیص، فعالیت، پایداری ، سراشیا مارسسنس
تقدیم به
پدر و مادر عزیز و مهربانم که در سختی ها و دشواری های زندگی همواره یاوری دلسوز و فداکار و پشتیبانی محکم و مطمئن برایم بوده اند…
سپاس و ستایش خدای عزوجل که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درخشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید.
در اینجا وظیفه خود می دانم از زحمات بی دریغ استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر خواجه به سبب راهنمایی ها و کمک های ارزنده شان در به انجام رسانیدن این پایان نامه و نیز امکاناتی که در اختیارم قرار دادند، تشکر فراوان نمایم.
از جناب آقای دکترحسن نیا که مشاوره این پایان نامه را به عهده داشتند، سپاسگذارم.
از سرکار خانم دکتر دبیرمنش و بویژه سرکار خانم دکتر اکبری به دلیل یاری ها و راهنمایی های بی چشمداشت شان نهایت تشکر را دارم و از یکایک دوستانم در آزمایشگاه بیوشیمی دانشگاه تربیت مدرس که در طول این پایان نامه مرا یاری کردند، سپاسگذارم. از آقای دکتر نژاد ستاری رئیس محترم دانشکده علوم پایه ), واحد علوم تحقیقات تهران) که داوری این پایان نامه را پذیرفتند و در جلسه دفاع حاضر شدند متشکرم.
فهرست مطالب
عنوان شماره صفحه
چکیده
TOC \o “1-3″ \h \z \u فصل اول : کلیات
1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………. 2
1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق………………………………………………………………….5
1-2-1 آنزیم ها5
1-2-2 غربالگری screeningآنزیم ها واهمیت آن6
1-2-3 منابع آنزیمی7
1-2-3-1 میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمی7
1-2-3-2 موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمی8
1-2-3-3 میکروارگانیسم هایGRAS8
1-2-4 کلکسیونهای میکروب (Culture Collection)به عنوان منابع میکروارگانیسم ها9
1-2- 5 بازار جهانی آنزیم10
1-2-6 پروتئازها11
1-2-6-1 اعمال پروتئازها12
1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها17
1-2-7 کاربرد پروتئازها22
1-2-7-1 صنعت شوینده22
1-2-7-2 صنعت چرم23
1-2-7-3 صنایع دارویی24
1-2-7-4 صنایع غذایی25
1-2-8 سراشیا مارسسنس26
1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن28
1-2-10 روشهای DNA نوترکیب و اهمیت آن29
1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن30
1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن)31
1-2-13 سیستم بیانpET32
1-2-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب34
هدف از انجام پروژه36
فصل دوم: پیشینه پژوهش
2-1 ادبیات و سوابق مربوطه………………………………………………………………………………39
فصل سوم: روش شناسی
3-1مواد شیمیایی42
3-2 میکروارگانیسم ها ومحیط های کشت مورد استفاده43
3-2-1 میکروارگانیسم ها و پلاسمیدها43
3-2-2محیط های کشت میکروبی44
3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز45
3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسی46
3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم46
3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم46
3-4-3 دمای بهینه47
3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیکی آنزیم47
3-5 جداسازی باکتری48
3-5-1 استخراج DNAژنومی48
3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR48
3-5-2-1 مراحل PCR ……………………………………………………………………………..49
3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A 50
3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک51
3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز51
3-6 روشهای الکتروفورزی53
3-6-1 SDS-PAGE53
3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100)53
3-7 فنون مربوط به DNA نوترکیب54
3-7-1 ساختار ناقل کلونینگ54
3-7-2 آماده سازی قطعهDNA برای انتقال به درون وکتور55
3-7-3 استخراج DNA از روی ژل56
3-7- 4 مراحل کلون مجدد56
3-7-5 مستعدکردن باکتری DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)58
3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α 59
3-8 بافرCracking60
3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62
3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب62
3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز63
3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب66
3-10-1 بافرهای موردنیاز تخلیص پروتئین نوترکیب66
3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب67
فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها4-1 جداسازی باکتری70
4-2 استخراج DNAژنومی70
4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی70
4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+)71
4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب75
4-6 منحنی استاندارد77
4-7 اثر pH روی فعالیت آنزیم77
4-8 دمای بهینه آنزیم78
4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……………………………………………………………….79
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1 نتیجه گیری نهایی88
5-2 پیشنهادات88
منابع و مأخذ89
فهرست منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………..89

فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43
جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال
عنوان شماره صفحه
شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34
شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55
شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71
شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72
شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73
شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74
شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75
شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77
نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78
نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79
نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80
فصل اولکلیات مقدمهپروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قلیایی شدن بیش از حد خون می باشد بطوریکه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیراستروئیدی در درمان استفاده می شود ( Mazzone ,1990).
منابع تولید آنزیمها بسیار متنوع است. بطوریکه از صد ها آنزیمی که بطور تجاری استفاده می شود بیش از نیمی از آنها از قارچ و مخمر و بیش از یک سوم آنها از باکتری ها و باقی مانده از گیاهان و حیوانات حاصل می شود. بنا به دلایل زیر میکروبها به عنوان منابع آنزیمی نسبت به گیاهان و جانوران ترجیح داده می شوند:1- عموما تولید آنها ارزانتر است 2- آنزیمهای حاصل از آنها قابل پیش بینی و قابل کنترل تر هستند، 3- بافتهای گیاهی و جانوری نسبت به میکروارگانیسم ها مواد مضر بیشتری دارند (مانند ترکیبات فنلی در گیاهان، مهارکننده های داخل سلولی و پروتئازها)، 4- نسبت به گیاهان و جانوران راحت تر می توان میکروب ها را از نظر ژنتیکی دستکاری نمود، 5- میکروارگانیزم ها را می توان در مقادیر بالا و در یک مدت زمان نسبتا کم از طریق روشهای تخمیر کشت داد 6- پروتئین های میکروبی اغلب نسبت به همتاهای جانوری و گیاهی خود پایدارترند. 7-منابع قابل اعتمادی از مواد اولیه جهت رشد آنها به راحتی فراهم میشود. بطور کلی می توان گفت محدودیت تولید آنزیم های حیوانی و گیاهی از یک سو و تولید ناکافی این منابع برای پاسخ به در خواست جهانی تولید آنزیم و توجه را به سوی آنزیم های میکروبی معطوف کرده است (Kroner, 1984).
امروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰۰ بازاری معادل ۱.۵ بیلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است. از میان آنزیم ها آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئازها، آمیلاز، استراز و لیپازها حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰تن در سال) مربوط به پروتئازها می باشد. پروتئازها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی، دارویی، چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود (Gupta, 2004). از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیاپپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. سراپپتیداز متالوپروتئاز حاوی روی خارج سلولی و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و با جرم مولکولی63250 دالتون می باشد که توسط انتروباکتریوم سراشیا غیر پاتوژن E15 تولید می شود. این میکروارگانیسم در ابتدا در اواخر ۱۹6۰ از روده کرم ابریشم جدا شد (Hase& Finkelstein , 1993).
این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود (Raskin, 1999). سراپپتیداز دارای خواص ضد التهابی قوی و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید است. کاهش درد از دیگر ویژگی های آن است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین ها یا القاکننده درد از بافتهای ملتهب است (Mazzonie et al, 1990). بنابراین با توجه به مزایای فوق میتوان ازآن به عنوان یک آنزیم دارویی استفاده کرد.
1-2 بیان مسئله و ضرورت تحقیق
1-2-1 آنزیم هاموجودات زنده به لحاظ دارا بودن کاتالیزورهای زیستی که اصطلاحا آنزیم نامیده می شوند، قادر به کسب انرژی از محیط و مصرف سریع آن می باشند. همچنانکه در مورد کاتالیزورهای معدنی مشاهده می شود. آنزیم ها قادر به تسریع واکنش های شیمیایی بوده ولیکن در تعادل نهایی شرکت نمی کنند. برخلاف کاتالیزورهای معدنی، آنزیم هادارای دامنه عمل بسیار ظریفی هستند و در مقایسه، دامنه بسیار محدودی از مواد را کاتالیز می کنند و یا اینکه در بعضی موارد تنها یک واکنش را کاتالیز می کنند. آنزیم ها بنا به تعریف در شرایط خاصی از pH، درجه حرارت و غلظت سوبسترا بهینه فعالیت دارند و ممکن است به کوفاکتورهای ویژه ای نیاز داشته باشند.
آنزیم ها بر حسب نوع واکنشی که انجام می دهند به 6 گروه اصلی تقسیم بندی می شوند:
اکسیدوردوکتازها
ترانسفرازها
هیدرولازها
لیازها
ایزومرازها
لیگازها1-2-2 غربالگری ((screening آنزیم ها و اهمیت آنبا غربالگری ارگانیسم ها به منظور فعالیت های بیوکاتالیزی مختلف، می توان محصولات تولید شده توسط آنها را که نسبت به وظایف خود در خلال فرایند تکامل سازش یافته اند به دست آورد.بنابراین غربالگری از جنبه های مختلف یک سرمایه گذاری مناسب محسوب می گردد (Dalboge& Dalboge,1998). غربالگری بیوکاتالیست های جدید با اهداف آکادمیک و علوم پایه و یا به منظورهای کاربردی-صنعتی صورت می گیرد (Xuyang et al, 1995). منابع تولید کننده آنزیم ها بسیار متعدد هستند. اما میکروارگانیسم ها بنا به دلایلی که به آنها اشاره خواهد شد مهمترین و عمده ترین منبع تولید کننده آنزیم ها هستند که مد نظر می باشند. فرآیند های اولیه در تحقیقات و به دست آوردن یک انتخاب و غربالگری محصول آنزیمی می باشند. جستجو به منظور یافتن یک ژن کد کننده ویژه برای آنزیم هدف، دارای اهمیت ویژه است. در گذشته این فرآیند منحصرا شامل غربالگری میکروارگانیسم های زنده بود. (غربالگری میکروبی کلاسیک). اما با بکار گیری روش های نوین بیولوژی مولکولی، غربالگری بدون نیاز به کشت ارگانیسم ها قابل انجام می باشد (Richardson et al, 2002 ). البته هر روشی دارای محدودیت هایی است و ترکیبی از تکنیک ها (combinational screening) اغلب بسیار موفقیت آمیز است (Aehle, 2004). برای شروع فرآیند جستجو و کشف، تنوع عظیم از میکروارگانیسم ها در طبیعت بهترین مژدگانی است (Kristjansson&Gudmundur, 1995).
تنوع متابولیکی به وجود آمده در 85% از تاریخ زمین که حیات محدود به میکرو ارگانیسم ها است واقعا شگفت انگیز است. در غربالگری جمع آوری نمونه ها از منابع طبیعی می تواند بدون هیچ تمایزی صورت گیرند (مثل نمونه های خاک) یا شرایط اکولوژیک در این بررسی مورد توجه قرار گیرد و یک جستجوی هدفدار از یک زیستگاه خاص و ویژه که احتمال یافتن یک فعالیت آنزیمی یا یک خصوصیت آنزیمی ویژه در آن وجود دارد انجام شود. در صورتیکه منابع مورد جستجو و کاوش قبلا کمتر مورد بررسی قرار گرفته باشند و یا جدیدا کشف شده باشند، احتمال دستیابی به تنوع بیشتر ژنومی و استخراج میکروب های جدید (novel) بسیار افزایش می یابد. در کنار موارد فوق راهکارهایی که بر اساس تاکسونومی می باشد و شامل بررسی سیستماتیک از ارگانیزم های شناخته شده است نیز می تواند موفقیت آمیز باشد. امروزه غربالگری با تکنیک های جدید نظیر تکامل جهت یافتهدستیابی به فعالیت های جدید، خصوصیات جدید و بهبود بیوکاتالیست ها از جنبه های مختلف، همچنین پی بردن به مکانیسم های دخیل در آنها شتاب بیشتری گرفته است (Ashie , 2003) و (Bronscheuer& Pohl, 2001 ).
1-2-3 منابع آنزیمی1-2-3-1 میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمیمنابع تولید آنزیمها بسیار متنوع است. میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین و مهمترین منبع تولید آنزیمها محسوب می گردند. در صنعت منابع جانوری و گیاهی به ترتیب تنها %8 و %3 از کل آنزیمها را شامل می شوند و سایر آنزیم های مورد استفاده منشأ میکروبی دارند (Horikoshi, 1995). بنابه دلایل زیر میکروبها به عنوان منابع آنزیمی نسبت به گیاهان و جانوران ترجیح داده می شوند:1- برای تولید عموما ارزانند، 2- آنزیمهای موجود در آنها بیشتر قابل پیش بینی و کنترل هستند، 3- بافتهای گیاهی و جانوری مواد مضر بیشتری دارند (مانند ترکیبات فنلی در گیاهان، مهارکننده های داخل سلولی و پروتئازها)، 4- نسبت به گیاهان و جانوران راحت تر می توان میکروب ها را از نظر ژنتیکی دستکاری نمود، 5- میکروارگانیزم ها را می توان در مقادیر بالا و در یک مدت زمان نسبتا کم از طریق روشهای تخمیر کشت داد. 6- پروتئین های میکروبی اغلب نسبت به همتاهای جانوری و گیاهی خود پایدارترند (Waites et al 2001).
با پیدایش تکنولوژی DNA نوترکیب و نیازهای جدید، میکروارگانیسم ها به عنوان منابع آنزیمی حتی اهمیت بیشتری یافته اند. جستجو و یافتن بیوکاتالیست ها، هم با اهداف آکادمیک و هم با جنبه ها و اهداف کاربردی صورت می گیرد. در هر دو حالت میکروارگانیسم ها ارجحیت دارند. این امر اگر با اهداف آکادمیک صورت گیرد محقق اغلب از دامنه وسیعی از منابع، انتخاب را انجام می دهد. این میکرو ارگانیسمها متعلق به هر سه حوزه Eukaryotes , Bacteria , Archaea می باشند.
1-2-3-2 موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمیجالب است که اغلب آنزیمهای میکروبی قابل تجاری شدن در تعداد معدودی از جنس های قارچی و باکتریایی یافت می شوند و در نقاط خاصی از موقعیت های تاکسونومیک تجمع یافته اند. شناخته شده ترین آنها عمدتا متعلق به گونه هاب باکتریاییBacillus وPseudomonas و قارچهای Ascomycete شامل جنس هایTricoderma,Fusarium ,Aspergillusهستند. بعلاوه گونه های متعلق به Rhizomucor Homicolarو Mucor تولید کننده برخی از آنزیم های صنعتی می باشند.
1-2-3-3 میکروارگانیسم هایGRASاغلب پروتئین ها و آنزیمهای صنعتی مهم توسط تعداد معدودی از ارگانیسم ها که جزءGRAS
(generally recognized as safe) دسته بندی می گردند، تولید می شوند. میکروارگانیسمهای GRAS شامل باکتری هایی نظیر Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis به علاوه سایر گونه های متعلق به bacilli, lactobacilli وstreptomyces می باشند.
قارچ های GRAS شامل اعضای گونه های جنس Aspergillus, Penicillum, MucorوRhizopus هستند. مخمرها نظیر Saccharomyces cerevisae نیز GRAS می باشند. میکروبهای GRASغیر بیماریزا و غیر سمی می باشندو نباید آنتی بیوتیک تولید نمایند (Kenddd& Cabral , 1987) و (Waites et al , 2001).
1-2-4 کلکسیونهای میکروب (Culture Collection)به عنوان منابع میکروارگانیسمهامیکروارگانیسمها را می توان از طریق غربالگری یا کلکسیون سویه ها به دست آورد. این کلکسیون ها در بسیاری از آزمایشگاه های مرتبط با تکنولوژی آنزیمی جمع آوری و تهیه شده اند. به علاوه در بسیاری از کشورها کلکسیون های ملی زیر نظر دولت ایجاد شده اند. تقریبا 500 کلکسیون میکروبی در سراسر دنیا وجود دارد. این کلکسیون ها سرویس هایی را در اختیار سازمانهای صنعتی و یا آکادمیک قرار می دهند. سویه ها عموما به صورت لیوفیلیزه نگهداری می شوند و در کنار آن c-DNA یا DNA ژنومی نیز در برخی موارد موجود می باشد (Waites et al , 2001).
با وجود تکنولوژی DNA نوترکیب و روشهای مبتنی بر مهندسی ژنتیک، جستجوی میکروارگانیسم های جدید یا فعالیت آنزیمی جدید هنوز هم بسیار حائز اهمیت است.
میکروارگانیسم ها یک راه حل عملی را برای بهبود فعالیت های آنزیمی پیش رو قرا می دهند. در حال حاضر، عقیده بر این است که برای تولید هر نوع محصول هدف یک میکروارگانیسم یا کاتالیست آنزیمی مشتق شده از یک میکرو ارگانیسم میتوان از طبیعت بدست آورد. اگر چه میکروارگانیسم ها با چشم غیر مسلح دیده نمی شوند اما بیوسفر را تحت سلطه خود دارند. به عنوان مثال تخمین زده می شود که یک گرم خاک می تواند بالغ بر 4000 گونه باکتریایی مختلف داشته باشد (Torsvik et al, 1990). در حال حاضر تخمین ها برای تعداد کل گونه های میکروبی روی زمین بین یک میلیون تا یکصد میلیون می باشد اما تنها حدود 5000 گونه میکروبی در منابع علمی آورده شده است (Short, 1997). از طرف دیگر روشهای مهندسی ژنتیک با وجود تمام پیشرفت هایش با چالش هایی روبروست:
1- تاخوردگی ناصحیح پروتئین، 2- عدم گلیکوزیلاسیون پروتئین های یوکاریوتی در باکتری ها، 3- حذف نشدن متیونین انتهای آمین .گرچه مهندسی ژنتیک قادر به ایجاد آنزیمهای جدید یا بهبود یافته می باشد، طراحی ژنهای جدید که توانایی های جدیدی کد می نمایند و طراحی، شناخت و بهبود خصوصیات آنزیمی از جنبه های فعالیت و پایداری بسیار مشکل می باشد زیرا اطلاعات در دسترس و دانش ما در ارتباط با اساس مولکولی آنها ناچیز است. بنابراین یافتن منابع جدید و غربالگری ارگانیسم ها به منظور جداسازی بیوکاتالیستهای جدید بسیار مهم بوده وبه عنوان یک روش اصلی در یافتن آنزیمهای جدید باقی مانده است (Wahler& Reymond, 2001) و (Horikoshi, 1995).
1-2- 5 بازار جهانی آنزیمبازار آنزیم موقعیتی مرکزی در اقتصاد جهانی پیدا کرده است بطوریکه تولید تجاری آنزیم یکی از پر سود ترین بازارهاست. در سال 1987، بازار جهانی آنزیم ، 450 میلیون دلار آمریکا و در سال 2008، حدود 3 میلیون دلار آمریکا و در دهه ی اخیر رشد متوسط سالیانه، 9درصد بوده است.در این میان سه دسته آنزیم شناسایی شده است:1. آنزیم های صنعتی (آمیلازها، پروتئازها، کاتالازها، ایزومرازها، لیپازها، سلولازها و …)
2. آنزیم های مورد استفاده در تشخیص طبی ( گلوکز اکسیداز، الکل دهیدروژناز، هگزوکیناز، کلسترول اسیلاز و غیره)
3. آنزیم های مورد استفاده در داروسازی ( آسپاراژیناز، پروتئاز، لیپاز، استرپتوکیناز و غیره) (Crueger& Crueger, 1990).
1-2-6 پروتئاز هاتاریخچهحدود 30 سال قبل پروتئازها را به عنوان آنزیم های تجزیه کننده ای معرفی کردند که فقط می توانند هیدرولیز کلی پروتئین ها را انجام دهند. پیشرفت های اخیر در روش های اندازه گیری و استفاده از سوبسترا های اختصاصی مشخص کرده است که آنزیم های هیدرولیز کننده پروتئین تغییرات انتخابی و خیلی اختصاصی را در پروتئینها با هیدرولیز محدود انجام می دهند. بعلاوه پروتئازها نقش مهمی را در آزمایشگاه و کلینیک و همچنین در فرآیند های صنعتی ایفا می کنند.
پروتئازها از دهه 1960 به عنوان مواد افزودنی به شوینده ها مطرح شدند و استفاده تجارتی از آنها به سرعت توسعه پیدا کرد. به عنوان مهمترین آنزیم های صنعتی، پروتئاز ها حدود 60 درصد کل تجارت آنزیم ها را شامل می شوند که دو سوم پروتئاز های تجاری تولید شده منشا میکروبی دارند.
از مهمترین پروتئازهای میکروبی که به صورت تجاری موجود می باشند، پروتئازهای قلیایی حاصل از
Bacillus licheniformis هستند که در تولید شوینده ها استفاده می شوند، پروتئازهای حاصل از Mucor که در تولید پنیر کاربرد دارند و پروتئازهای حاصل از Aspergillus oryzae که در تغییر خمیر نان و تولید سس سویا استفاده می شوند، اهمیت دارند. این پروتئاز ها به عنوان مهمترین آنزیم های دارای تولید بالا در جهان مطرح می باشند. به هر حال، پروتئاز های دیگر ی نیز در فرآیندهای مختلفی بخصوص در صنایع غذایی نقش دارند و بکار می روند که در بین آنها پروتئاز های قارچی اهمیت خاصی دارند.
1-2-6-1 اعمال پروتئازهاخصوصیات کلی:
دارای خصوصیات فیزیکی و شیمیایی و کاتالیتیکی متفاوتند.
نقش در فرآیند متابولیکی و تنظیمی درارگانیسم های پروکاریوت و یوکاریوت دارند.
.پروتئازهای خارج سلولی با تجزیه سوبستراهای پلی پپتیدی بزرگ به مولکولهای کوچک باعث تامین پپتید ها و اسید آمینه های ضروری برای رشد میکروارگانیسم ها می شوند.
پروتئاز های داخل سلولی نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای متابولیکی و همچنین نقش حیاتی در بازیابی پروتئین دارند که تعادل بین سنتز و تخریب پروتئین را حفظ می کند.
در کنترل بسیاری از اعمال فیزیولوژیکی از جمله هضم مواد، تغییرات هورمونی، تجمع پروتئین های ویروسی، پاسخ ایمنی بدن، التهاب، باروری، انعقاد خون، از بین بردن لخته خون، کنترل فشار خون، بازیابی دیواره سلولی در باکتری ها، تشکیل اسپور در باکتری، تندش اسپور، جدا شدن کنیدی از کنیدیوفور در قارچ ها و بیماری زایی نقش دارند. پروتئازها همچنین در تنظیم بیان ژن ها، ترمیم DNA و سنتز DNA نقش دارند (Kalisz, 1988).
منابع تولید کننده پروتئاز
گیاهان: گیاهان پروتئازهای متعددی با خواص فیزیکوشیمیایی متفاوت تولید می کنند. از میان پروتئازهایی که توسط گیاهان تولید می شوند و بیشترین اهمیت را در بین آنها دارند، می توان به پروتئازهای پاپائین، برومولین و کراتیناز اشاره نمود. مشکل اصلی در تولید پروتئازهای گیاهی احتیاج به زمان زیاد در روند تولید می باشد که کاربرد آنها را محدود نموده است.
پاپائین: یک سیستئین پروتئازی است که از شیره خام میوه گیاه Papayacarica که درمناطق استوایی میروید استخراج می شود. این پروتئاز گیاهی در محدوده pH بین 5 تا 9 مقاوم است و تا دمای 80 یا 90 در حضور سوبسترا پایدار استو کاربرد وسیع در صنایع غذایی برای تهیه پروتئین هیدرولیز شده دارد.
برومولین: نوعی سیستئین پروتئاز می باشد که از ساقه و آب آناناس تهیه می شود.(از ریشه و آب آناناس) و در محدوده pH بین 5 تا 9 فعال است و در دمای C°70 غیر فعال می شود.
کراتیناز: پروتئاز گیاهی می باشد که در هضم آنزیمی پشم و مو به منظور تولید اسید آمینه ضروری لیزین و کمک به سیستم هضم فاضلاب کاربرد دارد.
جانوران:
پروتئازهای تولید شده توسط سلولهای حیوانی در صنعت کاربردهای وسیعی دارند. از جمله مهمترین آنزیم های کاربردی در صنعت می توان به مواردی همچون تریپسین، کیموتریپسین، پپسین و رنین اشاره نمود.
Trypsin: تریپسین آنزیم اصلی دستگاه گوارش است که مسئول هیدرولیز پروتئین های غذا است. نوعی سرین پروتئاز با وزن مولکولی 23 کیلودالتون می باشد و در کنترل بیولوژیک آفات حشرات، تولید هیدرولیزات پروتئینی و در تهیه ی محیط کشت میکروبی و بعضی کاربردهای تخصصی پزشکی استفاده می شود.
Chymotrypsin: آنزیم کیموتریپسیناز پانکراس در روده ترشح می شود.pH مناسب برای فعالیت آن 8 می باشد. این آنزیم تنها پیوندهای پپتیدی را مورد حمله قرار می دهد که گروه های کربوکسیل در آنها از اسید آمینه تیروزین یا فنیل آلانین و یا تریپتوفان تامین شده باشد. دارای وزن مولکولی 23 کیلو دالتون می باشد که استفاده در تشخیص پزشکی دارد.
Pepsin: پپسین پروتئاز اسیدی از نوع آسپارتیل پروتئاز می باشد. فعالیت بهینه بین pH 1 و 2 است و در pH بالاتر از 6 غیر فعال می شود و وزن مولکولی 34 کیلودالتون دارد.
Renin: آنزیمی با وزن مولکولی 30 کیلودالتون می باشد که در صنایع لبنی به هنگام تهیه ماست و پنیر مورد استفاده قرار می گیرد (Rao et al, 1998).
آنزیم های میکروبی
میکروارگانیسم های تولید کننده پروتئاز، به دلایلی همچون قابلیت کشت در سطحی وسیع، تولید آنزیم در مقیاس بالا و داشتن نیمه عمری بیشتر نسبت به سایر پروتئازها اهمیت خاص دارند. اغلب این آنزیم ها را می توان هفته ها بدون تغییر آشکار در فعالیت آنزیمی نگهداری نمود. در ضمن به دلیل تولید آنزیم خارج سلولی، بر خلاف پروتئازهای حیوانی و گیاهی که باعث سهولت روند مراحل عملیات پایین دستی و مراحل خالص سازی آنزیم می شود، هدف اصلی در مطالعات علمی برای کاربرد در صنعت قرار دارند (Kumar& Takagi, 1999).
باکتری ها
پروتئازهای باکتریایی یکی از بزرگترین کلاس آنزیم های صنعتی می باشد که در حدود 40% از کل فروش آنزیم ها در سراسر جهان به شمار می روند. ناتوانی پروتئازهای گیاهی و جانوری در از بین بردن مطالبات جهانی استفاده از آنزیم ها، باعث توجه ویژه به پروتئازهای میکروبی شده است (Claudia et al 1993) و (Rao et al, 1998). در صنعت منابع گیاهی و جانوری برای تولید آنزیم به ترتیب مقادیر 8% و4% از کل آنزیمها را شامل می شوند و سایر آنزیمهای استفاده شده منشأ میکروبی دارند (Bronscheuer& Pohl, 2001). منابع میکروبی به دلیل ویژگی های زیر به منابع گیاهی و حیوانی ترجیح داده می شوند.
دارای تنوع بیوشیمیایی گسترده ای هستند.
برای تولید ارزان هستند.
دارای قابلیت بهتر در دستکاری ژنتیکی برای تولید آنزیم های جدید به منظور کاربرد های مختلف می باشند.
مواد مضری که ممکن است فعالیت آنزیم را کاهش دهد یا تخریب کند در گیاهان و جانوران بیشتر است.
میکروارگانیسم ها دارای رشد سریع و. نیاز به فضای محدود برای کشت سلول می باشد.
پایداری پروتئین های میکروبی نسبت به همتاهای گیاهی وجانوری خود بیشتراست (Waites et al, 2001) و (Chaplin& Bucke, 1990).
قارچ ها
از دیگر منابع اصلی تولید کننده پروتئازها می توان قارچ ها را نام برد. قارچ ها نسبت به باکتری ها، پروتئازهای متنوع تری را تولید می کنند که در محدوده pH وسیع 4 تا 11 فعال هستند. در ضمن دامنه هضم سوبسترایی وسیع تری نسبت به پروتئازهای باکتری ها دارند. با وجود تمامی مزیت های مذکور، پروتئاز های قارچی به دلیل فعالیت پایین آنزیم و عدم پایداری در برابر حرارت کمتر از پروتئازهای باکتریایی در صنعت استفاده می شوند. در میان قارچ های تولید کننده پروتئاز، آسپرژیلوس ها بالاترین میزان پروتئاز را تولید می کنند و از لحاظ تجاری حائز اهمیت هستند. از پروتئازهای قارچی به دلیل فعالیت بهینه در pH های اسیدی بین 4 تا 5/4 و پایداری و فعالیت در pH بین5/2تا 6، در صنایع غذایی به منظور لخته نمودن شیر و تخمیر پنیر استفاده می شود.
ویروس ها
ویروس ها پروتئازهای متعددی را برای پردازش پروتئین های کپسیدی و آنزیم های پلیمرازی تولید می نمایند. دانشمندان توانسته اند از پروتئازهای ویروسی علیه پروتئین های ویروسی ایجاد کننده بیماری های مهلک همچون سرطان و AIDS استفاده نمایند. ویروس ها انواع پروتئازها شامل سرین پروتئازها، آسپارتیک پروتئازها و سیستئین پپتیدازها را تولید می نمایند ولی تا به حال هیچ متالوپروتئازهای در بین پروتئازهای ویروسی مشاهده نشده است (Lu et al, 1969).
1-2-6-2 دسته بندی پروتئازهاراه های گوناگونی برای طبقه بندی پروتئاز ها وجود دارد اما به طور کلی پروتئازها را بر اساس سه اصل اساسی زیر طبقه بندی می کنند.
الف) نوع واکنشی که کاتالیز می نمایند ب) طبیعت شیمیایی جایگاه فعال آنزیم ج) ارتباطات تکاملی بر اساس ساختار آنزیم.
در مجموع پروتئازها با توجه به محل اثرشان به دو گروه اگزوپپتیداز و آندوپپتیداز دسته بندی می شوند و هر کدام را نیز با توجه به جایگاه فعالشان به زیرگروه هایی تقسیم می نمایند.
اگزوپپتیداز ها
این گروه از پروتئازها در یکی از دو انتهای کربوکسیل یا آمینی پروتئین عمل می نمایند و بر همین اساس نیز به دو گروه آمینوپپتیداز و کربوکسی پپتیداز دسته بندی می شوند.
آمینوپپتیدازها
این دسته از پروتئازها، اسیدهای آمینه را به شکل تک تک، دوتایی و یا سه تایی از انتهای آمینی پروتئین آزاد می سازند. آمینو پپتیدازها توسط گستره وسیعی از میکروارگانسیم ها شامل باکتری ها و قارچ ها تولید می شوند. به طور کلی آمینوپپتیدازها، آنزیم های داخل سلولی می باشند و در آسپرژیلوس اوریزه نوع خارج سلولی آن نیز گزارش شده است (Labbe et al, 1974).
کربوکسی پپتیدازها
این دسته از پروتئازها اسیدهای آمینه را به صورت تک تک یا دو تایی از انتهای کربوکسیل پروتئین آزاد می نمایند و بر اساس جایگاه فعال آنزیمی به سه گروه سرین کربوکسی پپتیداز، متالوکربوکسی پپتیداز و سیستئین کربوکسی پپتیداز تقسیم می شوند.
اندوپپتیدازها
این دسته از پروتئازها در جایگاه های داخل پلی پپتید عمل می نمایند و بر اساس اسید آمینه موجود در جایگاه فعالشان به چهار دسته تقسیم می شوند.
1.سرین پروتئازها
2. سیستئین پروتئازها
3. آسپارتیک پروتئازها
4 . متالوپروتئازها
سرین پروتئازها
این گروه از پروتئازها در تعداد کثیری از ارگانیسم ها از قبیل ویروس ها، باکتری ها و یوکاریوت ها مشاهده شده است و جزء آنزیم های حیاتی برای ارگانیسم ها می باشند. سرین پروتئاز به اشکال گوناگون اگزوپپتیداز، الیگوپپتیداز و امگا پپتیدازی در ارگانیسم های مختلف مورد بررسی قرار گرفته است. این آنزیم ها در ناحیه فعال خود یک سرین دارند و عموما” بوسیله DFP(Diisopropyl fluorophosphates) یا Phenylmethylsulphonyl fluoride) PMSF ) مهار می شوند. به طور کلی به چند گروه اصلی تقسیم می شوند که شامل کیموتریپس(SA)، سابتیلیزین(SB)، کربوکسی پپتیداز C(SC)، D-Ala-D-Ala پپتیدازA در اشرشیاکلی (SE) و مهار کنندهLex A (SF) می باشند (S=Subtilisin). در سه گروه اول یعنی SA، SB، SC توالی همسان سه تایی (Triad) شامل اسید های آمینه سرین (نوکلئوفیل)، آسپارتیک اسید (الکتروفیل) و هیستیدین در جایگاه فعال قرار می گیرد. نکته دیگر حائز اهمیت، حضور مناطق کاملا محافظت شده اسیدآمینه گلایسین (GLY) در کنار توالی همسان سه تایی می باشد که تشکیل موتیف (GLY-Xaa-Ser-Yaa-Gly) را داده است (Shimogaki et al, 1991).
سرین پروتئازها عموما” در pH خنثی یا قلیایی فعال هستند و فعالیت بهینه آنها در pH بین 7 تا 11 می باشد. آنها دارای اختصاصیت وسیعی در سوبسترا بوده و از آن جمله فعالیت استرولیتیک قابل ملاحظه ای در برابر سوبستراهای استری دارند. وزن مولکولی آنها معمولا” کم (5/18 تا 35 کیلودالتون) است ولی بزرگترین سرین پروتئاز گزارش شده در میکروارگانیسمها پروتئاز موجود در Blakeslea trispora با وزن مولکولی 126 کیلودالتون بوده است. بیشتر آنها نقطه ایزوالکتریک بین 4/4 تا 2/6 دارند (Kalisz, 1988).
سیستئین پروتئازها
این دسته از پروتئازها در پروکاریوت ها و یوکاریوت ها تولید می شوند و فعالیت پروتئولیتیک آنها به جایگاه دوگانه حاوی سیستئین و هیستیدین بستگی دارد. عامل اصلی تمایز در این دسته آنزیم ها ترتیبcys-his، His-cys می باشد که باعث تفاوت در عملکرد آنها می شود (Gupta et al,2002). سیستئین پروتئازها نسبت به محلولهای سولفیدریل مانند pCMB، TLCK، اسید ایدواستیک، ایدواستامید و فلزهای سنگین حساس بوده و در حضور محلولهای احیاکننده مانند سیانید پتلسیم یا سیستئین و EDTA فعال می شوند. بیشتر این آنزیم ها در pH بین 5 تا 8 فعال بوده و بعضی از آنها بوسیله مواد احیاکننده تحریک می شوند (Kalisz, 1988). پپتیداز گیاهی پاپائین شناخته شده ترین سیستئین پروتئاز می باشد در سیستئین پروتئازها یک مجموعه کاتالیک سه تایی سیستئین-هیستیدین-آسپارتات وجود دارد که در واقع آنالوگ سرین-هیستیدین-آسپارتات در سرین پروتئازها است.
آسپارتیک پروتئازهابیشتر آسپارتیک پروتئازها به خانواده پپسین تعلق دارند. خانواده دیگری که در این گروه قرار می گیرد پروتئازهای ویروسی مانند رتروپپسین (پروتئاز ویروس ایدز) هستند. آسپارتیک پروتئازها برای فعالیت کاتالیک احتیاج به گروه آسپارتیک اسید دارند. مطالعات کریستالوگرافی نشان داده است که این آنزیم به صورت دو قطعه ای (دو لوبی) است که سایت فعال بین دو لوب همولوگ قرار می گیرد. هر لوب یک گروه آسپارتات را ارائه می دهد. این دو باقیمانده آسپارتیل در مولکول فعال در فضا کاملا در نزدیکی هم قرار دارند و یکی از آنها یونیزه شده در حالیکه دیگری یونیزه نشده است.در این بین رتروپپسین دارای یک ریشه آسپارتات (مونومریک) است که برای فعال شدن آنزیم باید دیمریزه شدن صورت گیرد. در کاتالیز با آسپارتیک پروتئازها برخلاف سایر گروه های پروتئازها (سرین و سیستئین پروتئازها) شکل گیری واسطه ای با پیوند کووالانسی (آنزیم- سوبسترا) دیده نمی شود و حمله نوکلئوفیلی با انتقال همزمان دو پروتون صورت می گیرد(Horikoshi, 1999).
آسپارتیک پروتئازها به وسیله فعالیت حداکثر در pH پایین (3 تا 4) و عدم حساسیت به مهارکننده های سه گروه دیگر آنزیم ها شناخته می شوند. بیشتراسپارتیک پروتئازها به ترکیبات اپوکسی کتون و دی آزوکتون در حضور کاتیون های مس حساسند. بیشتر اسپارتیک پروتئازها دارای وزن مولکولی بین 30 تا 45 کیلودالتون بوده و نقطه ایزوالکتریک آنها معمولا” بین 4/3 تا 6/4 می باشد.
متالوپروتئازها
متالوپروتئازها متنوع ترین گروه پروتئازها و شامل آنزیم هایی مانند کلاژناز، هموراژیک توکسینو ترمولیزین باکتریایی هستند تمام متالوپروتئازهای گزارش شده دارای pH بهینه بین 5 تا 9 بوده و این آنزیم ها به حضور کاتیون دو ظرفیتی وابسته هستند بنابراین نسبت به محلولهای Chelat کننده فلز مانند EDTA حساس می باشند ولی تحت تاثیر مهارکننده های سرین پروتئازها یا محلول های سولفیدریل قرار نمی گیرندو تعدادی از آنزیم های مهار شده بوسیله EDTA، در حضور یون هایی مانند روی، کلسیم و کبالت دوباره فعال می شوند.متالوپروتئازها فراوان بوده ولی فقط در تعداد کمی از قارچ ها گزارش شده اند. بیشتر متالوپروتئاز های باکتریایی و قارچی حاوی روی می باشند که به ازای هر مولکول آنزیم یک اتم روی گزارش شده است. اتم روی برای فعالیت آنزیم ضروری می باشد و کلسیم برای پایدار کردن ساختمان پروتئین لازم است. بیشتر متالوپروتئازها دارای موتیف His-Glu-Xaa-Xaa-His هستند که بخش اتصال یون فلزی (معمولا Zn) را تشکیل می دهد (Kalisz, 1988) و (Horikoshi, 1999).
1-2-7 کاربرد پروتئاز هاامروزه پروتئازهای میکروبی تقریباً 40 درصد از فروش سالیانه آنزیمی در صنایع گوناگون از قبیل شوینده ها، صنایع غذایی، دارویی، چرم، تولید پروتئین های هیدرولیز شده، صنایع فیلم و مدیریت بازیافت ضایعات را به خود اختصاص داده اند. پروتئازهایی که در صنایع غذایی و شوینده کاربرد دارند، در مقادیر زیاد تهیه می شوند و به صورت خام (Crud) تولید می شوند. در حالیکه پروتئازهایی که در صنایع دارویی مورد استفاده قرار می گیرند در مقادیر کم تولید شده، اما قبل از اینکه مورد استفاده قرار گیرند به تخلیص فراوان نیاز دارند (Rao et al, 1998) و (Godfrey& West, 1996).
1-2-7-1 صنعت شویندهمهمترین کاربرد پروتئازهای قلیایی در صنعت، استفاده در پودرهای ماشین رختشویی و ظرفشویی به عنوان افزودنی در فرمولاسیون شوینده ها می باشد. بطوریکه 30 درصد از بازار فروش آنزیم های صنعتی را به خود اختصاص داده است.
تاریخچه کاربرد پروتئازها در شوینده ها به سال 1914 باز می گردد که برای اولین بار، شوینده حاوی پروتئاز به نام Burnus توسط دانشمندان آلمانی Rohm, Hassساخته شد. پروتئاز به کار رفته در پودر این شوینده حاوی عصاره پانکراس و کربنات سدیم بود.
اولین دترجنت حاوی آنزیم میکروبی نیز در سال 1956 با نام تجاری Bio-40 به بازار عرضه شد. در سال 1960 شرکت Novo، آنزیم آلکالاز که پروتئاز ترشحی باکتری B.licheniformis بود را با نام تجاری Biotex به بازار عرضه نمود و در پی این روند پروتئازهای صنعتی متعددی به بازار تجاری معرفی شدند.
عوامل اصلی گزینش پروتئازها برای استفاده در فرمولاسیون پودرهای شوینده ها شامل توانایی آنزیم در هضم نمودن محدوده وسیعی از سوبستراها است که مربوط به رنگ، مواد غذایی، خون و ترشحات بدن می باشند، پایداری و بقا آنزیم در pH و دمای بالا، سازگاری با عوامل اکسیدکننده موجود در فرمولاسیون شوینده ها، عوامل Chelate کننده یونهای موجود در شوینده ها و در ضمن داشتن نیمه عمر بالا و فعالیت در حداقل بین 4/0 تا 8/0 درصد نسبت به کل مواد موجود در شوینده ها می باشد.
اما عامل کلیدی در انتخاب پروتئازها، pH نقطه ایزوالکتریک (pI) می باشد، که بایستی نزدیک به pI حاصل از ترکیبات به کار رفته در فرمولاسیون پودرهای شوینده مورد استفاده در ماشین رختشویی و ظرفشویی باشد. آنزیم های Savinase, Esperase از باسیلوس های قلیا دوست که محصول شرکت Novo Industry هستند، pI=11 دارند که باعث پایداری آنها در محدوده وسیعی از pH قلیایی می شود.
استفاده از آنزیم های هیدرولیزکننده در شوینده ها باعث کوتاه نمودن زمان agitation و کاهش دمای شستشو در حین عملکرد ماشینهای رختشویی می شود.در ضمن نتایج آزمایشات نشان داده که استفاده همزمان از ترکیبی از چند آنزیم هیدرولیزی مانند لیپاز، آمیلاز و سلولاز همراه با پروتئاز باعث بهینه نمودن عملکرد پروتئاز در پودرهای رختشویی می شود(Rao et al, 1998) و (Samal et al, 1990) و (Phadatare et al, 1993) و (Gupta et al,2002) و (Nielsen et al, 1981) و (Horikoshi, 1999).
1-2-7-2 صنعت چرممراحل تهیه چرم شامل خیساندن، موزدایی، نرم کردن پوست و دباغی می باشد. از آنجائیکه جنس پوست و مو پروتئینی است، پروتئازها نقش مفیدی در رفع مشکلات چرم سازی ایفا می نمایند. در زمان گذشته در روند تهیه چرم، از مواد شیمیایی مضر از قبیل سولفات سدیم استفاده می نمودند که به دلیل آلودگی و انتشار آن، بسیار خطرناک می باشد در صورتیکه اخیرا از پروتئازها که به طور اختصاصی ترکیبات غیر کلاژنی و پروتئین های غیر فیبریلی مانند آلبومین و گلوبین ها را تجزیه می نمایند و ضرری برای جنس چرم ندارند استفاده می شود که نتیجه آن هضم اختصاصی ترکیبات اضافی می باشد. پروتئازهای قلیایی میکروبی برای جذب سریعتر آب و کاهش زمان موردنیاز برای خیساندن پوست، همچنین همراه با آهک آبدار و سدیم کلراید به منظور موزدایی استفاده می شوند. تریپسین را همراه با پروتئازهای باسیلوسی و آسپرژیلوس برای جلا دادن به کار می برند (Neklyudov et al, 2000).1-2-7-3 صنایع داروییتاثیر انواع پروتئازها با اختصاصیت های گوناگون به عنوان عوامل درمانی بسیار مفید بوده است. تجویز خوراکی پروتئین هایی از آسپرژیلوس اوریزا به عنوان کمک کننده هضمی برای بهبود سندرم های کمبود هضم آنزیمی معین استفاده شده است. آنزیم ها معمولا با آنتی بیوتیک ها ترکیب می شوند و به عنوان پماد یا ژل یا به صورت یک پانسمان مرطوب و خشک به کار می روند. کلاژناز کلستریدیال یا سوبتیلیزین (سابتیلیزین) به صورت ترکیبی با آنتی بیوتیک های مختلف برای درمان سوختگی ها و زخم ها استفاده می شود. از آسپارژیناز جدا شده از E.coliبرای حذف آسپارژین از جریان خون در اشکال مختلفی از لوکمی های لنفوسیتیک استفاده می شود. اخیرا سیستئین پروتئازها، بویژه کاتپسین های لیزوزومی مورد توجه صنعت داروسازی قرار گرفته اند. کاتپسین های لیزوزومی مسئول فرآیندهای فیزیولوژیکی شامل تجزیه پروتئین سلولی می باشند. کاتپسین ها اهداف دارویی بسیاری از بیماری ها مانند Osteoporosis، آرتریت روماتوئید، Arterio sclerosis، تصلب شرائین، سرطان و بیماری های التهابی و اتوایمیون هستند (Rao et al, 1998).
1-2-7-4 صنایع غذاییتاریخچه استفاده از پروتئازها در صنایع غذایی، به زمان بسیار قدیم باز میگردد که پروتئازهای میکروبی در تهیه پنیر، نان، فراوری گوشت، تهیه محصولات سویا، پروتئین های هیدرولیز شده و … استفاده میشد.
صنایع لبنی: مهمترین کاربرد پروتئازها در صنایع لبنیبه هنگام تهیه پنیر می باشد. آنزیم های مورد استفاده در لخته نمودن شیر به سه دسته رنین های حیوانی، پروتئازهای میکروبی و کیموزین های تولیدی توسط روش های مهندسی ژنتیک، تقسیم می شوند که دو گروه اول جزء دسته آسپارتیک پروتئازهای اسیدی با وزن مولکولی 30 تا 45 کیلودالتون می باشند. برای اولین بار در سال 1998، کیموزین های تولیدی از طریق تکنیک DNA نوترکیب برای استفاده در صنایع تولید پنیر مورد ارزیابی قرار گرفتند و به تدریج جایگاه اصلی را در پنیرسازی به خود اختصاص دادند به طوریکه شرکت Genencor، تولید آنزیم نوترکیب قارچ آسپرژیلوس نایجر، واریته awamori را به سطح تجاری رساند و هم اکنون نیز سه نوع کیموزین نوترکیب در تهیه پنیر استفاده می شوند.
صنایع نان: مشکل اصلی در تهیه نان، آرد گندم است زیرا که متشکل از پروتئین نامحلول گلوتن می باشد که این امر مشکلات فراوانی را در تهیه نان ایجاد می کند. با تیمار نمودن گلوتن توسط اگزو آندو پروتئازهای قارچ آسپرژیلوس اوریزه می توان این مشکل را رفع نمود (Rao et al, 1998) و (Neklyudov et al, 2000).
1.هیدرولیزات پروتئین: هیدرولیزات پروتئین مخلوطی با ارزش غذایی بالا می باشد که توسط تیمار نمودن مواد پروتئینی طبیعی همچون کازئین، آب پنیر، سویا و… حاصل می شود. هیدرولیزات پروتئین مخلوطی است که در تنظیم فشار خون، فرمولاسیون غذای کودک، محصول رژیمی درمانی و افزودنی آب میوه ها و نوشابه های بدون الکل برای تقویت غذایی نقش بسزایی ایفا می نماید. با هیدرولیز نمودن مواد پروتئینی طبیعی، توسط پروتئازهای قلیایی می توان به محصولی با ارزش غذایی بالا دست یافت (Rebeca et al, 1991). سالانه معادل 106×145 لیتر آب پنیر از فرایند تهیه پنیر حاصل می شود که در صورت تیمار نمودن آن با پروتئاز قلیایی می توان محصول فراوانی با ارزش غذایی بالا تهیه نمود (Perea et al, 1993).
کاربردهای دیگر پروتئازها:
به غیر از کاربردهای مذکور که اصلی ترین استفاده های پروتئاز در صنعت می باشند می توان به سایر مواد کاربرد تجاری پروتئازهای میکروبی همچون بازیابی نقره از فیلم های عکاسی و اشعه ایکس مصرف شد (Gajji et al, 1996)، تهیه آسپارتام(شیرین کننده غیر قندی) (Rao et al, 1998)، مدیریت تبدیل پسماند های پروتئینی به بیوماس مفید (Ichida et al, 2002) و صنایع ابریشم اشاره نمود (Puri, 2001).
1-2-8 سراشیا مارسسنسسراشیا مارسسنس، باکتری گرم منفی، متعلق به خانواده انتروباکتریاسه است که با تولید سه آنزیم Lipase، DNAase و Gelatinase از سایر جنس های متعلق به این خانواده قابل تمایز می باشد. مشخصه دیگر این باکتری تولید رنگدانه قرمز غیر محلول در آب بنام پرودی جیوسین (Prodigiosin) است. این رنگدانه نوعی متابولیت ثانویه است که توسط Pseudomonas magneslorubra،Vibrio psychroerythrous وSerratia marcescens تولید می شود (Gerber, 1975).
پرودی جیوسین از رنگدانه های قرمز خانواده تری پیرولی است. فرآیند تولید این رنگدانه به صورت پیش سازهای منو و بی پیرول است که به صورت جداگانه سنتز شده و سپس به شکل نهایی پرودی جیوسین ترکیب می شوند (Boger& Patel, 1988). تولید رنگدانه تنها در درصد کمی از ایزوله ها دیده می شود. مطالعات نشان می دهد که سویه های فاقد توان تولید رنگدانه در تولید عفونت های بیمارستانی شاخص ترند. این باکتری مانند سایر اعضای خانواده انتروباکتریاسه، بر روی محیط کشت های سنتزی در شرایط هوازی به خوبی رشد می کند (Pryce& Terry, 2000) و (Mandarville, 2001) و (Nobutaka et al, 2001).
اندازه آن 5/0- 8/0 میکرومتر و طول آن 9/0-2 میکرومتر است. کلونی های روی نوترینت آگار، مات، گرد، محدب، سفید و صورتی یا قرمز است(پیگمان معمولا در بعضی کلونی ها دیده می شود.) سراشیا مارسسنس در دماهای بین 5 تا 40 درجه سانتیگراد و در pH از 5-9 رشد می کند. رنگدانه در کلونی های قدیمی تر ناپدید می شود. بعضی از سویه ها فاقد رنگدانه هستند و حداقل یک سویه(D1) رنگدانه نارنجی-قرمزشدید تولید می کند که محو نمی شود. سراشیا مارسسنس از دیگر باکتری های گرم منفی به واسطه توانایی در هیدرولیز کازئین متمایز می شود که به آن اجازه تولید متالوپروتئینازهای خارج سلولی را می دهد. سراشیا مارسسنس باعث طیف وسیعی از عفونت ها مثل پنومونی، مننژیت، سپتی سمی، عفونت مجاری ادرار، اندوکاردیت، کونجانکتویت و عفونت زخم می شود.سراشیا مارسسنس تعدادی پروتئین خارج سلولی شناخته شده از جمله کیتیناز، همولیزین، سیدروفور، لیپاز، پروتئاز و نوکلئاز ترشح می کند (Hejazi& Falkiner, 1997) و (Kida et al, 2007).
طبقه بندی علمی
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Gamma Proteobacteria
Order: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Serratia
Species: S. marcescens
1-2-9 سراشیا پپتیداز و اهمیت آناز میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. سراپپتیداز یک آنزیم پروتئولیتیک قوی است که اولین بار از باکتری سراشیا مارسسنسE-15 که در روده کرم ابریشم ژاپنی یافت شد، جدا گردید و دارای وزن مولکولی kDa 50 می باشد. همچنین این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود. پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیر استروئیدی در درمان استفاده می شود .سراپپتیداز تجزیه فیبرین، فعالیت ضد التهابی و ضد تورم را در تعدادی از بافت ها القا می کند و اثرات ضد التهابی آن نسبت به دیگر آنزیم های پروتئولیتیک بیشتر است. علاوه بر کاهش التهاب، یکی از بیشترین مزایای آن کاهش درد است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین های القا کننده درد از بافت های ملتهب است (Raskin, 1999) و (Mazzone et al, 1990). سراشیوپپتیداز، برادیکینین، هیستامین و سروتونین را که باعث ورم (ادم)می شودرا هیدرولیز می کند و ورم را کاهش می دهد. سراپپتاز هم اکنون برای اهداف درمانی سنتز شده و فروخته می شود. این دارو در اروپا و ژاپن تحت نام ثبت شده Danzen و تحت نام های متنوعی شامل Danzen TM، Aniflazym TM، Serrazyme TM، Nemesulide، Serodase خرید و فروش می شود. این آنزیم تمایل خاصی به مولکول های پروتئینی مرده داشته، هضم و شکست پروتئین ها را در بدن بر عهده دارد و باعث تجزیه لخته خون، بافت زخمی و بافت مرده می شود. این آنزیم با پاکسازی فیبر ها از خون و سیستم لنفاوی و پاکسازی موکوس از طریق کاهش سلول های نوتروفیلی و از بین بردن التهاب از بدن به سیستم خود ایمنی کمک می کند تا عملکرد بهتری داشته باشد. در درمان شریان مسدود شده در بیماری های کرونر، پاکسازی پلاک های شریانی، کاهش میگرن و به حداقل رساندن اثرات بیماری قلبی و جلوگیری از حمله قلبی مفید است (Mohankumar et l, 2011).
1-2-10 روش هایDNA نوترکیب و اهمیت آنتکنیک های DNA نوترکیب در جهت جداسازی، وارد کردن و بیان ژن های موجودات مختلف در میزبانهای مختلف بکار رفته (Rao et al, 1998) و اهداف مختلفی را دنبال می کنند از جمله: بررسی توالی اسید نوکلئیک ژن مربوطه و یا تولید محصول آن ژن در میزبان دیگر به منظور خالص سازی و تولید انبوه در جهت مصارف صنعتی و اقتصادی. بنابراین در این راه، انتخاب میزبان تولید کننده پروتئین، سطح بیان محصول، بیان داخل و یا خارج سلولی، تغییرات پس از ترجمه و همچنین ویژگیهای رشد سلول میزبان از اهمیت بسزایی برخوردار است (Makrides, 1996).
1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژنامروزه سیستم های بیانی زیادی از باکتریایی و مخمر گرفته تا حشرات و حیوانات در جهت بیان ژن خارجی به کاررفتهاست (Marino, 1989)، اما از میان تمامی سیستم های موجود، باکتری گرم منفی اشریشیا کولی بدلیل توانایی هایش بیشترین کاربرد را در این زمینه داشته است:
به سرعت رشد می کند.
محیط کشت آن ارزان می باشد.
ژنتیک آن کاملا” مشخص شده است.
براحتی می تواند وکتورهای کلونینگ را در خود تکثیر کند.
با فرمانتورهای بزرگ سازش پذیر می باشد.
بدلیل سابقه تاریخی استفاده از اشریشیاکولی، بسیاری از دستکاریهای ژنتیکی در جهت کاربردهای مختلف کلونینگ و بیان بر روی آن اعمال شده و گونه های تغییر یافته مختلفی از آن در سطح تجارتی تهیه شده و به راحتی در دسترس است (Banyx, 1999).
اما باید توجه داشت که تمامی ژن ها را نمی توان در سیستم اشریشیاکولی بیان کرد. مثلا” اگر محصول نوترکیب چند زیر واحدی بوده و یا اینکه احتیاج به تغییرات پس از ترجمه داشته باشد، بدلیل اینکه سیستم اشریشیاکولی توانایی ایجاد تغییرات پس از ترجمه رادر سطح بالا ندارد، بهتر است از میزبان های یوکاریوتیک استفاده شود. به هر حال اشریشیاکولی بعنوان یک سیستم بیانی، در جهت تولید بالا و اقتصادی بسیاری از پروتئین هایی که اندازه کوچک و ساختار ساده ای دارند، بسیار مفید می باشد.
1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن)در یک وکتور بیانی، عناصر اصلی و نحوه آرایش آنها باید بدقت طراحی شوند تا بیشترین سطح بیان را ایجاد کنند. این عناصر عبارتند از:
بخش شروع همانندسازی: برای افزایش تعداد نسخه های یک ژن، آن ژن را درون پلاسمیدها کلون کرده و این پلاسمیدها نیز در حالت استراحت خود همانندسازی و تعدادشان را در سلول میزبان افزایش میدهند (Cornelis, 2000).
مارکر مقاومت به آنتی بیوتیک: برای تشخیص سلولهایی که پلاسمید را پذیرفته اند و در ضمن اثر فشار انتخابی آنتی بیوتیک بر روی سلول ها برای نگه داشتن پلاسمید. وجود ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلاسمیدها ضروری است. بدین معنی که وقتی سلول در معرض آنتی بیوتیک قرار می گیرد، مجبور است برای زنده ماندنش پلاسمید حاوی ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را در خود نگه دارد (Jonasson et al, 2002).
پروموتر نسخه برداری: پروموتر، در فاصله 10 الی 100 نوکلئوتیدی بالا دست محل اتصال ریبوزوم قرار داشته و تحت کنترل ژنی تنظیمی است که این ژن یا جزئی از پلاسمید است یا در ژنوم میزبان قرار دارد. پروموترهای اشریشیاکولی معمولا” از دو هگزامر تشکیل شده که در 10- و 35- بالا دست نقطه شروع ترجمه قرار دارند (Mizukoshi, 1982)، اما پروموترهایی که در پلاسمیدهای بیانی بکار می روند باید اولا” بسیار قوی باشند تا نسخه برداری زیادی از روی ژن نوترکیب انجام شود و ثانیا” شدیدا” تحت کنترل باشند تا فقط در موقع القاء، ژن نوترکیب را بیان کنند، چون اگر در حین رشد سلول بیان بالا داشته باشیم، از رشد سلول جلوگیری شده و پس از قرارگیری سلول در موقعیت استرس، پلاسمید را حذف میکند. خصوصیت دیگری که باید در یک پروموتر بیانی وجود داشته باشد، آسان و ارزان بودن القاء آن می باشد. از پروموترهایی که امروزه در سطح وسیعی استفاده می شوند، پروموترهای trc یا tac هستند که از اپرون lacمشتق شدهاند و با IPTG القاء می شوند. اما چون این ماده بسیار گران می باشد، استفاده از آن در سطح بالا مقرون به صرفه نبوده و از جایگزین آن یعنی لاکتوز استفاده می کنند که با وجودیکه کمی ضعیف تر از IPTG عمل میکند، چون ارزانتر است مناسب تر می باشد (Makrides, 1996) و (Hanning& Makrides, 1998 ).
با توجه به مطالب ارائه شده در این قسمت، به شرح خصوصیات منحصر بفرد سیستم بیان pET که در این تحقیق از آن استفاده شده است نیز در مبحث بعد می پردازیم.
ناحیه شروع ترجمه
پایان دهنده های ترجمه و نسخه برداری
محل وارد کردن ژن
1-2-13 سیستم بیان pETرایج ترین سیستم بیانی که امروزه از آن استفاده می شود سیستم pET می باشد؛ بطوریکه حدود 80 درصد پروتئین هایی که ساختار سه بعدی آنها در سال 2003 در بانک اطلاعاتی پروتئین (PDB) به ثبت رسیده است، درون سیستم های اشریشیاکولی بیان شده و 90 درصد آنها از طریق سیستم pET صورت گرفته است (Rao et al, 1998). با وجودیکه در حال حاضر حدود 40 نوع تجاری از سیستم بیانی pET وجود دارد، Studier و همکارانش برای اولین بار در سال1990 این سیستم را شرح دادند (Dubendorff& Studier, 1991).
این سیستم دارای پروموتورهای هیبرید، در محل وارد کردن ژن برای قرار گرفتن چند ژن در کنار هم و دیگر دستکاریهای ژنتیکی در جهت اهداف مختلف بیان می باشد. برای بیان ژن، این سیستم باید درون میزبانی قرار گیرد که توسط قطعه فاژی DE3 لیزوژنه شده باشد. قطعه DE3، T7RNA polymerase را کد کرده که تحت کنترل پروموتور lacUV5 بوده و بوسیله IPTG القاء می شود. از طرف دیگر ژن lacI که یک کپی از آن در ژنوم میزبان و یک کپی از آن در pET وجود دارد، بازدارنده LacI را تولید می کند که هم پروموتور lacUV5 میزبانی و هم پروموتور هیبریدی T7/lac پلاسمیدی را سرکوب می کند. پس وقتی که IPTG به محیط اضافه می شود، LacI را از هر دو اپراتور lac خارج و به خود می چسباند، و در نتیجهRNA polymerase T7 بیان شده و RNA پلیمراز حاصله، ژن موجود در پروموتور هیبریدی T7/lac را بیان می کند (شکل 1-3). بنابراین با توجه به اینکه توالی پروموتور T7 قابل شناسایی توسط RNA پلی مرازهای اشریشیا کولی نمی باشد، بیان خارج از کنترل وجود ندارد و چونRNA polymeraseT7 با سرعت 230 نوکلئوتید در ثانیه الگوبرداری می کند، 5 برابر سریعتر از RNA پلی مراز اشریشیا کولی عمل کرده و باعث می شود mRNA های فراوانی از روی ژن نوترکیب درون میزبان تولید شود. مناسب ترین میزبان برای بیان سیستم pET نیز اشریشیا کولی BL21 می باشد که هم قطعه DE3 و هم پروموتور lacUV5 را در ژنوم خود دارد (Sorensen& Mortensen, 2005).

شکل1-1) رونویسی ژنT7 (کد کننده T7 RNA Polymerase) در میزبان های سیستم بیانی pET ( لیزوژن های λDE3) توسط پروموتر L8-UV5کنترل می شود. ژنT7 بعنوان دومین ژن در یک mRNA پلی سیسترونی رونویسی می شود. بازدارنده lac (محصول ژن lac) به lacO1 متصل می شود و با اپراتورهای کاذب lacO2 و lacO3 به منظور جلوگیری از رونویسی توسطRNA Polymerase اشریشیاکولی برهمکنش می دهد. القاء کننده IPTG به بازدارنده متصل می شود و تمایل آن را به lacO1، کاهش می دهد و بنابراین رونویسی را امکانپذیر می سازد.
1-2-14 استراتژی خالص سازی محصول نوترکیبپس از تولید موفق پروتئین نوترکیب، باید چندین مرحله خالص سازی انجام گردد تا یک پروتئین با فعالیت بیولوژیکی تخلیص گردد. بطور کلی مراحل خالص سازی شامل 3 مرحله می شود:
رها سازی پروتئین از سلول
خالص سازی اولیه
خالص سازی با روش های مختلف کروماتوگرافی
در مرحله اول اگر پروتئین بصورت داخل سلولی تولید شده باشد، توسط روش های مختلف لیز سلولی مثل سونیکاسیون و غیره پروتئین از سلول جدا می گردد ولی اگر محصول خارج سلولی باشد، احتیاجی به مرحله اول نمی باشد. هدف اصلی از خالص سازی اولیه، خارج کردن محصول از محیط کشت و همچنین غیرفعال کردن پروتئازها می باشد که معمولا” این مرحله را با دستگاه سانتریفیوژ و یا رسوب پروتئینی بوسیله نمک انجام می دهند. پس از این دو مرحله، چون محصول هنوز هم دارای ناخالصی های زیادی می باشد، برای خالص سازی نهایی، محصول حاصله را بر روی ستون های مختلف کروماتوگرافی وارد می کنند (Jonasson et al, 2002).
سیستم های تمایلی:یکی از بهترین راه ها برای کاهش مراحل خالص سازی، استفاده از ستون های تمایلی برای پروتئین نوترکیب می باشد؛ به همین دلیل امروزه استفاده از قطعات ادغام شده به پروتئین های نوترکیب جهت خالص سازی های بعدی امری رایج می باشد.
اولین گزارش درباره استفاده از ادغام های ژنی در خالص سازی تمایلی به سال 1983بر می گردد (Uhlen et al, 1983 ) و از آن زمان تا به حال تعداد زیادی از سیستم های ادغامی تمایلی برای، Poly Histidin affinity tag می باشد که برای پروتئین هایی که مستعد ایجاد اجسام تجمعی هستند زیاد به کار می رود زیرا به راحتی می توان اجسام تجمعی را به ستونهای تمایلی فلزی چسبانیده و با محلولهای مناسب احیاء کرد.
این tag را می توان براحتی توسط تکنیک PCR به پروتئین نوترکیب متصل کرد. بعنوان مثال در سیستم pET توالی Poly-His قبل یا بعد از محل ورود ژن قرار داشته و در نتیجه پس از بیان ژن کلون شده، پروتئین نوترکیب دارای دنباله هیستیدینی بوده و براحتی می توان پروتئین نوترکیب را از دیگر پروتئین ها خالص کرد.
یکی از نکات منفی استفاده از قطعات ادغامی، جداسازی این قطعات پس از انجام مراحل خالص سازی از پروتئین نوترکیب می باشد. در نتیجه ممکن است ماده مورد استفاده برای تجزیه قطعه ادغامی، بر روی پروتئین نوترکیب هم اثر گذاشته و آن را تخریب کند. بنابراین امروزه آنزیم های خاصی طراحی شده که با ویژگی بالا قطعه ادغامی را تجزیه کرده ولی بر روی پروتئین نوترکیب اثری نمی گذارد (Jonasson et al, 2002).هدف از انجام پروژهامروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰8 بازاری معادل 3 میلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است. در این میان آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئاز، آمیلاز، استراز و لیپاز حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰ تن در سال) مربوط به پروتئاز ها می باشد. پروتئاز ها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی و دارویی و چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود. از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیا پپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. با توجه به مزایای ضد التهاب و ضد درد این آنزیم، می توان از آن در صنایع دارویی بهره برد. به منظور تحقق این هدف، در ابتدا می بایست جداسازی سویه میکروبی از خاک های مناطق بومی ایران که مولد آنزیم سراپپتیداز می باشد صورت گیرد. سپس با بررسی ژن آنزیم های سراپپتیداز های جدا شده در مطالعات قبلی در بانک های ژنی مختلف، پرایمر های مناسب برای این آنزیم طراحی شده و شرایط مختلف برای جدا سازی این آنزیم از سویه مورد نظر بررسی می شود. چنانچه لازم باشد برای جدا کردن ژن این آنزیم کتابخانه ژنومی تهیه خواهد شد. بعد از جداسازی ژن آنزیم مورد نظر، یک وکتور بیانی مناسب مانند pET انتخاب شده و با استفاده از آنزیم های محدود الاثر مناسب این ژن در وکتور کلون خواهد شد. با مطالعات انجام شده یک سویه باکتری E.coliبه عنوان میزبان بیانی انتخاب شده و وکتور نوترکیب در آن ترنسفورم خواهد شد. سپس به بررسی بیان آنزیم در شرایط مناسب در میزبان فوق پرداخته و بهترین شرایط بیانی به منظور به دست آوردن حداکثر مقدار آنزیم فراهم می شود. چنانچه لازم باشد از روش های مختلف بهینه سازی به منظور افزایش راندمان تولید آنزیم استفاده خواهد شد و با استفاده از ستون های مختلف کروماتوگرافی مانند کروماتوگرافی تمایلی، آنزیم مورد نظر خالص خواهد شد و در مرحله آخر فعالیت آنزیم در شرایط مختلف دما، pH بررسی خواهد شد تا شرایط بهینه فعالیت آنزیم به دست آید.
فصل دوم پیشینه تحقیق2-1 ادبیات و سوابق مربوطه
در سال 1992 کلونینگ و بیان و ترادف یک ژن پروتئاز به نام tpr حاصل ازPorphyromonas gingivalis W83 در Escherichia coliانجام شد و بیان پروتئاز حاصل از Porphyromonas gingivalis از محیطLB Agar حاوی Skim milk1% جدا شده بود که کلون آن kb3 بود که برای پروتئازی با وزن مولکولی kDa64 کد شده بود و نتایج نشان داد که احتمالا پروتئاز بیان شده در Escherichia coli یک تیول پروتئاز است (Bourgeau et al, 1992).
در سال 1995 کلونینگ و آنالیز ترادف و تخلیص و ترشح لیپاز خارج سلولی توسطEscherichia coli از Serratia marcescens صورت گرفت. ژن کد کننده لیپاز خارج سلولی از Serratia marcescens توسط فاژ لامبدا در کتابخانه ژنومی مشخص شده است که در این تحقیق لیپاز از بخش شناور روی سطح کشت حامل وکتور بیان لیپاز خالص سازی شد و نتایج نشان داد که لیپاز حاصل از Serratia marcescens متعلق به گروهی از پروتئین های آنزیمی خارج سلولی ترشح شده توسط مسیر ترشحی کلاس 1 می باشد (Xuyang et al, 1995).
در تحقیقی دیگر در سال 1997 کلونینگ، بیان و ترادف ژن پروتئاز ازBacteroides forsythus ATCC 43037 صورت گرفت که در این تحقیق ترادف نوکلئوتیدی DNA الحاقی در کلون شامل bp272/1 برای kDa8/47 کد شده است (Saito et al,l 1997).
در گزارشی در سال



قیمت: 10000 تومان

متن کامل در سایت homatez.com

NameEmailWebsite

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *