— (597)

289687-1905
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
رشته : زیست شناسی
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس
استاد راهنما:
دکتر خسرو خواجه
استاد مشاور:
دکتر صادق حسن نیا
نگارش:
الهام حسنی
تابستان 1392
چکیده
پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند. سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. این آنزیم یک متالوپروتئاز حاوی روی است و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و جرم مولکولی50632 دالتون می باشد و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید می باشد.
در این مطالعه ابتدا جداسازی سراشیا مارسسنس مولد آنزیم سراپپتیداز صورت گرفت و توالی ژن سراپپتیداز از بانک ژنی NCBI بدست آمد و طراحی پرایمر صورت گرفت. پس از استخراج DNA ژنومی باکتری سراشیا مارسسنس به روشBoiling ، به عنوان الگو در تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفت و پس از تایید محصول PCR، ژن تکثیر یافته در وکتور TA کلون و سپس درون وکتور بیانی PET28 ساب کلون گردید .کلون انجام شده توسط برش آنزیمی، PCRو تعیین توالی تایید شد و پلاسمید نوترکیب با آنزیم Nde1 و Xho1 خطی شده وE.coli سویه BL21 توسط وکتور نوترکیب ترانسفورم و بیان پروتئین تحت القایIPTG و الکتروفورزSDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از ستون کروماتوگرافی نیکل-سفارز آنزیم مورد نظر تخلیص گردید.
آنزیم دارای pH بهینه 7 و دمای بهینه 55 درجه است. با رسم نمودار Michaelis-Menten محاسبه Km و Vmax صورت گرفت. مقادیر km و Vmax برای سوبسترای کازئین به ترتیب mM 04/0 و((mM/min 177/0 می باشد.
کلونینگ، بیان و تخلیص و تعیین ساختار ژن سرپپتیداز در این مطالعه تایید می شود. این پروتئین نوترکیب می تواند در مطالعات آینده در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی:
پروتئاز، سراپپتیداز، کلونینگ، بیان، تخلیص، فعالیت، پایداری ، سراشیا مارسسنس
تقدیم به
پدر و مادر عزیز و مهربانم که در سختی ها و دشواری های زندگی همواره یاوری دلسوز و فداکار و پشتیبانی محکم و مطمئن برایم بوده اند…
سپاس و ستایش خدای عزوجل که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درخشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید.
در اینجا وظیفه خود می دانم از زحمات بی دریغ استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر خواجه به سبب راهنمایی ها و کمک های ارزنده شان در به انجام رسانیدن این پایان نامه و نیز امکاناتی که در اختیارم قرار دادند، تشکر فراوان نمایم.
از جناب آقای دکترحسن نیا که مشاوره این پایان نامه را به عهده داشتند، سپاسگذارم.
از سرکار خانم دکتر دبیرمنش و بویژه سرکار خانم دکتر اکبری به دلیل یاری ها و راهنمایی های بی چشمداشت شان نهایت تشکر را دارم و از یکایک دوستانم در آزمایشگاه بیوشیمی دانشگاه تربیت مدرس که در طول این پایان نامه مرا یاری کردند، سپاسگذارم. از آقای دکتر نژاد ستاری رئیس محترم دانشکده علوم پایه ), واحد علوم تحقیقات تهران) که داوری این پایان نامه را پذیرفتند و در جلسه دفاع حاضر شدند متشکرم.
فهرست مطالب
عنوان شماره صفحه
چکیده
TOC o “1-3” h z u فصل اول : کلیات
1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………. 2
1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق………………………………………………………………….5
1-2-1 آنزیم ها5
1-2-2 غربالگری screeningآنزیم ها واهمیت آن6
1-2-3 منابع آنزیمی7
1-2-3-1 میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمی7
1-2-3-2 موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمی8
1-2-3-3 میکروارگانیسم هایGRAS8
1-2-4 کلکسیونهای میکروب (Culture Collection)به عنوان منابع میکروارگانیسم ها9
1-2- 5 بازار جهانی آنزیم10
1-2-6 پروتئازها11
1-2-6-1 اعمال پروتئازها12
1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها17
1-2-7 کاربرد پروتئازها22
1-2-7-1 صنعت شوینده22
1-2-7-2 صنعت چرم23
1-2-7-3 صنایع دارویی24
1-2-7-4 صنایع غذایی25
1-2-8 سراشیا مارسسنس26
1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن28
1-2-10 روشهای DNA نوترکیب و اهمیت آن29
1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن30
1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن)31
1-2-13 سیستم بیانpET32
1-2-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب34
هدف از انجام پروژه36
فصل دوم: پیشینه پژوهش
2-1 ادبیات و سوابق مربوطه………………………………………………………………………………39
فصل سوم: روش شناسی
3-1مواد شیمیایی42
3-2 میکروارگانیسم ها ومحیط های کشت مورد استفاده43
3-2-1 میکروارگانیسم ها و پلاسمیدها43
3-2-2محیط های کشت میکروبی44
3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز45
3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسی46
3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم46
3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم46
3-4-3 دمای بهینه47
3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیکی آنزیم47
3-5 جداسازی باکتری48
3-5-1 استخراج DNAژنومی48
3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR48
3-5-2-1 مراحل PCR ……………………………………………………………………………..49
3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A 50
3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک51
3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز51
3-6 روشهای الکتروفورزی53
3-6-1 SDS-PAGE53
3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100)53
3-7 فنون مربوط به DNA نوترکیب54
3-7-1 ساختار ناقل کلونینگ54
3-7-2 آماده سازی قطعهDNA برای انتقال به درون وکتور55
3-7-3 استخراج DNA از روی ژل56
3-7- 4 مراحل کلون مجدد56
3-7-5 مستعدکردن باکتری DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)58
3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α 59
3-8 بافرCracking60
3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62
3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب62
3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز63
3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب66
3-10-1 بافرهای موردنیاز تخلیص پروتئین نوترکیب66
3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب67
فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها4-1 جداسازی باکتری70
4-2 استخراج DNAژنومی70
4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی70
4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+)71
4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب75
4-6 منحنی استاندارد77
4-7 اثر pH روی فعالیت آنزیم77
4-8 دمای بهینه آنزیم78
4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……………………………………………………………….79
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1 نتیجه گیری نهایی88
5-2 پیشنهادات88
منابع و مأخذ89
فهرست منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………..89

فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43
جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال
عنوان شماره صفحه
شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34
شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55
شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71
شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72
شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73
شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74
شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75
شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77
نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78
نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79
نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80
فصل اولکلیات مقدمهپروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک

متن کامل در سایت homatez.com
NameEmailWebsite

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *