ارتباط وجود دارد [۲۱]. به طور کلی فاکتورهایی که زمان اولین تقسیم سلولی را تعیین میکند نامشخص هستند. اگر چه شرایط کشت (مانند همکشتی و کشت در اویداکت گوسفنده زنده) میتواند کینیتیک تکوین مراحل اولیه رویان را تحت تاثیر قرار دهد [۱۶۰]، اما احتمالاً فاکتورهای اصلی که این پارامترها را کنترل میکنند به کیفیت ذاتی تخمک [۹۲]، اسپرم [۱۷۰] یا هر دو بستگی دارد.
۱-۱۰- سلول?های رویانی
مطالعه مقایسهای تکوین رویان در vivo in و vitro in نشان داده است که تعداد سلولهایی که به ICM تمایز پیدا میکنند در رویانهای تولید شده در vitro in کم میشود [۱۶۳]. نشان داده شده است که یک تعداد حداقلی ICM برای ایجاد آبستنی لازم است. علاوه بر آن تخصیص تعداد زیادی از سلولهای به TE ممکن است سبب غیرطبیعی شدن آبستنی گردد، به عنوان مثال سبب افزایش وقوع سندرم جنین هیولایی و هیدرولانتوئیس شود [۷۷].
روشهای مختلفی برای شناسایی تعداد سلول?های ICM، TE و تعداد کل سلولهای رویانی و تعیین نسبت بین ICM:TE وجود دارد [۷۰،۶۱]. در موش رنگ?آمیزی افتراقی برای مطالعه میزان اهمیت ژن Ped بر تمایز سلولی در بلاستوسیست مورد استفاده قرار گرفته است. بلاستوسیستهای موش فاقد ژن Ped، بهطور معنیداری تعداد ICM کمتری در مقایسه با گروه شاهد خود دارند [۱۵]. با به کارگیری رنگ?آمیزی افتراقی این امکان وجود دارد که بتوان مقایسه خوبی از نحوه تمایز ICM در گونه?های مختلف پستانداران در شرایط مختلف کشت داشت [۱۶۲].
گزارش شده است که تعداد سلولهای رویانی میتواند شاخص خوبی از کیفیت و قابلیت زنده مانی رویان باشد. اگرچه معیارهای مرفولوژیکی به تنهایی شاخصهای ضعیفی هستند. نشان داده شده است که هنگامی?که زیگوت?های خوکی به اویداکت موش انتقال داده میشوند بر اثر افزایش تقسیمات سلولی زیگوت در اویداکت موش تعداد سلولهای رویانی در بلاستوسیستهای تولید شده دو برابر بلاستوسیستهایی است که از vitro in به دست میآید [۱۱۷]. نتایج مشابهی نیز هنگام انتقال رویانهای گاو به اویداکت خرگوش گزارش شده است [۵۹]. همچنین شرایط کشت پس از لقاح میتواند میزان اتصال سلول به سلول را در توده سلولی داخلی تحت تاثیر قرار دهد. نشان داده شده است که میزان اتصال سلول به سلول در توده سلولی داخلی رویانهای گاوی که به طور کامل در in vivo تولید شدهاند بسیار بیشتر از زمانی است که رویانهای IVM/IVF شده در اویداکت خرگوش و یا کاملاً در vitro in تولید شدهاند [۶۰] (شکل ۱-۷).
نحوه اتصال سلول به سلول در توده سلولی داخلی به الگوی متراکم شدن بلاستومرها هنگام مرولا بستگی دارد [۶۷،۳۵]. نشان داده شده است که عوامل زیادی مانند یون کلسیم [۳۵]، میکروتوبولها [۹۸]، میوزین [۱۵۰] و پروتئین کنیاز C [14]، هنگام متراکم شدن مرولا اتصال سلول به سلول را تحت تاثیر قرار میدهند. آستانه غلظت کلسیم برای متراکم شدن مرولا حدود ۲/۰-۱/۰ میلیمولار است [۳۵]. و ممکن است این عامل در کاهش اتصال سلول به سلول در ICM موثر نباشد. زیرا غلظت CaCl2 در محیط کشت ۸/۱ میلیمولار است.
فصل دوم
مروری بر متون گذشته

۲-۱- اثرات انجماد روی تخمک
مطالعات نشان داده اند که انجماد تخمک ها، به طور معنی داری موجب کاهش میزان تسهیم جنین های حاصله نسبت به جنین های حاصل از تخمک های غیر منجمد می گردد (۴۱.۵۹? در مقابل ۷۵?؛
P0.001). همچنین در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمکهای منجمد- ذوب شده، درصد بلاستوسیست ها در تخمک های منجمد بسیار کمتر از تخمک های غیر منجمد بوده است (۱۷.۰۲? در مقابل ۵۴.۲۸?، P 0.001 )]153 [.
مطالعات مختلف حاکی از وجود آسیب های فراساختاری گوناگونی در تخمک های منجمد- ذوب شده
می باشند که موجب اختلال در زنده مانی تخمک ها، از دست دادن پتانسیل تکاملی و کاهش میزان باروری آنها می گردد. در سایر مطالعات نیز وجود تغییرات ساختاری و میکروسکوپی در تخمک های منجمد- ذوب شده گزارش گردیده است که مهمترین آنها عبارتند از: تغییر در لایه زونا پلوسیدا ]۵۱[. کاهش نفوذپذیری انتخابی غشا پلاسمایی، کاهش میکروویلی ها، بهم ریختگی گسترده اووپلاسم ]۳۱[، تغییر در میکروتوبول ها و میکروفیلامنتها ] ۳۱،۱۳۵[، بهم ریختگی دوک تقسیم، آنیوپلوییدی ]۹۱[ و تکه تکه شدن هسته ]۱۰۷[. همچنین مشاهده شده است تغییرات مذکور ممکن است با توجه به گونه حیوانی و روش انجماد مورد استفاده متفاوت باشند ]۲۴[. مشاهده شده است که انجماد تخمک ها دارای تاثیر منفی بر مقادیر رونوشت های ژنی مربوط به برخی عملکردها و پتانسیل های تکاملی جنین دارد. در واقع، میزان تسهیم و درصدتولید بلاستوسیست جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده به طور معنی داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش می یابد ]۱۵۳[.
به منظور کاهش اثرات نامطلوب انجماد، بررسی های قابل توجهی در سال های گذشته انجام شده است که یکی از این بررسی ها کاهش حجم محلول های انجمادی اطراف تخمک به هنگام انجماد و دستیابی به حداقل حجم ضروری بدین منظور می باشد. در این راستا، وسایل مختلفی برای انجماد تخمک های تولیدی مورد استفاده قرار گرفته است که مهمترین آنها عبارتند از: شبکه های میکروسکوپ الکترونیکی ]۱۰۰[، نی کشیده باز ]۱۵۸[، کرایولوپ ]۸۰[ و اخیراً نیز کرایوتاپ ]۷۹[ که در آن حجم قطره انجماد کمتر از ۱ میکرو لیتر می باشد که بر روی یک ورق نازک پلاستیکی قرار گرفته و سپس به طور مستقیم در نیتروژن مایع قوطه ور می گردد.
لئونی و همکاران جهت بررسی کیفیت تخمک پس از انجماد به بررسی برخی ژن های دخیل در تکامل آن پرداختند که ژن های مورد بررسی عبارتند از: سوخت و ساز (N+a/K+ATPase)، تراکم
و تشکیل حفره
(E-CAD)، تنظیم چرخه سلولی (cyclin B و p34cdc2)، پاسخ به استرس (HSP90?) و عملکرد متابولیک سلول (H2A.Z، PAP، یوبی کویتین، B-اکتین) است. این ژنها به عنوان مارکرهای مولکولی بررسی کیفیت، در تخمک های نابالغ و بالغ گوسفند مورد ارزیابی قرار گرفتند ]۸۷[. به عنوان مثال، کمبود E-CADمی تواند بر چسبندگی سلول ها و تراکم آنها تاثیر بگذارد ] ۱۲۸،۴۳[، و کمبود Na+/K+ ATPase ممکن است بر سوخت و ساز تخمک ]۲۹[ و جنین ]۱۷۶[ تأثیر داشته باشد. در هر صورت، به نظر می رسد روند انجماد بر قابلیت تکاملی تخمک، با تغییر در بیان ژن، یا از طریق کاهش ذخایر ترنسکریپت گامت، و یا از طریق کوتاه شدن دم پلی (A) که احتمالا به علت فقدان آنزیم PAP است، تأثیر داشته باشد ]۱۳۵[.
۲-۲- اثر روش انجماد شیشهای
در مطالعه ای، اثر روش انجماد شیشه ای بر مولکول ها، اسکلت سلولی و قابلیت رشد و نمو تخمک های نابالغ گوسفند مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه مشاهده گردید تخمک های منجمد شده در مرحله GV بیشتر از تخمک های مرحلهMII مستعد ابتلا به آسیب های ناشی از انجماد می باشند، اگرچه در تخمک های منجمد شده در مرحله MII نیز آسیب های غیر قابل برگشت مشاهده می گردد که مهمترین این موارد عبارتند از: تغییر در پلیمریزه شدن میکروتوبول ها و میکروفیلامنت ها [۱۳۷] به بهم ریختگی دوک تقسیم، آنپلوییدی[۹۱]، ناهنجاریهای کروموزومی [۱۰۶]، مرگ سلولی و کاهش قابلیت تکاملی[۱۱۲،۸۱،۸۳،۸۴،۱۲۹]. برخی از آسیب های ساختاری و عملکردی تخمک های منجمد شده در مرحله GV عبارتند از: اندازه کوچک، نقص در اتصالات بین سلول های کومولوس و تخمک، کاهش جذب اسیدهای آمینه، کاهش سنتز پروتئین، نقص در متابولیسم انرژی [۱۱۳،۸۲،۸۱] و اختلال در چرخه عوامل تنظیم کننده سلول [۸۵]. پس از لقاح نیز تخمک های منجمد شده در مرحله GV، تسهیم همراه با تأخیر، قابلیت تکاملی کمتر بلاستوسیست ها [۸۸] و کاهش میزان باروری [۱۳۵] را نسبت به تخمک های بالغ منجمد شده نشان می دهند. [۸۷،۸۵].
۲-۳- بیان زیر واحدهای پمپ Na+/K+/ATPase در تخمک و جنین
پمپ Na+/K+/ATPase از دو زیر واحد تشکیل شده است؛ یک زیر واحد ? کاتالیتیک که به ATP متصل
شده و دارای یک محل اتصال برای ouabain، که یک مهار کننده اختصاصی پمپ مذکور است و یک زیر واحد زیر واحد ? غیر کاتالیتیک و گلیکوزیله که دارای نقش ساختاری بوده و برای قرار دادن زیرواحد ? داخل غشاء پلاسمایی ضروری است، می باشد] ۵۰،۱۵۷،۱۳[. هر دو زیر واحد برای کدگذاری یک خانواده چند زیر واحدی، با چهار ژن زیرواحد ? (۱?، ۲?، ۳?، ۴?) و سه ژن زیرواحد ? (۱?، ۲?، ۳?) هستند]۶،۱۳[. همچنین گزارش شده است که یک زیر واحد سومی، تحت عنوان زیرواحد ?، که با جایگاه ouabain مرتبط شده است نیز وجود دارد، و ممکن است در تعدیل فعالیت پمپ مذکور نقش داشته باشد ]۶۸[.
هر زیر واحد در جنین، بیان الگوی مکانی و زمانی مجزا دارد ] ۶۸،۱۷۳،۱۷۵[. بیان ژن برخی از ایزوفرم های پمپ Na+/K+/ATPase در موش مطالعه شده و مشاهده گردیده است که mRNA ایزوفرم های ۱?، ۳?، ۲? و ۳? در طول تکامل جنین قبل از لانه گزینی بیان شده اند ]۱۷۵[.
رونویسی از ایزوفرم ۲? در تخمک دیده شده، لیکن در مرحله پیش از لانه گزینی جنین این ایزوفرم دیده
نمی شود ]۹۷[، رونویسی از mRNA مربوط به ایزوفرم ۱? در زایگوت مشاهده شده است، بدین ترتیب که در مراحل دو تا هشت سلولی وجود نداشته و مجدداً در مراحل مورولا و بلاستوسیست بیان می شود ]۱۷۵[، در نهایت، مشاهده شده است که رونویسی از زیرواحد ? در تخمک و در مرحله جنینی، از اواسط مرحله هشت سلولی تا مرحله بلاستوسیست صورت می گیرد ]۶۸[. اگر چه چندین زیر واحد از mRNA ایزوفرم های Na+/K+/ATPase در تمام مراحل تکاملی جنین های پیش از لانه گزینی در موش بیان شده است، لیکن فقط ایزوفرم های ۱? و ۱? محدود به غشاء بازولترال تروفکتودرم می باشند. ایزوفرم های ۳?، ۲? و ۳?، در غشای پلاسمایی و در تمام مرحله بیان شده اند ]۹۷[. همچنین، زیرواحد ? از مرحله هشت سلولی در نوحی رأسی و بازولاترال سلول ها بیان شده است ]۶۸[.
در جنین گاو، mRNA مربوط به ایزوفرم های ۱?، ۲?، ۳?، و ۲? از مرحله زایگوت تا مرحله بلاستوسیست بیان شده اند و رونویسی از ایزوفرم ۱? تنها در مراحل مورولا و بلاستوسیست مشاهده گردیده است. رونویسی از ایزوفرم ۴? در هیچ یک از مراحل پیش از لانه گزینی مشاهده نگردید ]۱۰[. با استفاده از تکنیک های ایمونوفلورسانس، مشاهده گردید زیرواحدهای ۱? و ۳? پمپ Na+/K+/ATPase در حاشیه سلول، از مرحله زایگوت تا مرحله مورولا در جنین گاو بیان شدند ]۹[، در مرحله بلاستوسیست، زیر واحد ۱?، در نواحی بازولترال تروفکتودرم محدود می باشد، لیکن در حاشیه تمام سلول های ICM (توده سلولی داخلی) بیان می شود. در مقایسه، زیرواحد ۳?، در نواحی رأسی تروفکتودرم محدود بوده و در ICM دیده نمی شود ]۹[.
۲-۴- پمپ /k+ ATPase Na+
در رویان در حال تکوین سلولهای بیرونیتر نواحی راسی و غشای پایهای- جانبی برای انتقال یونهای اختصاصی هستند و در غشاهای راسی و پایهای- جانبی پمپهای /k+ ATPase Na+ متمرکز شدهاند. پمپ /k+ ATPase Na+ با فعالیت خود یونهای Na+ و Cl- را به فضای بین سلولی منتقل میکند و یک گرادیان اسمزی به وجود میآورد که سبب میشود مایعات به بین سلول?ها کشیده شود و در مورولا تجمع پیدا کند (شکل۲-۱).

با تجمع مایعات، سلولهای بیرونیتر پهن و کشیده میشوند و حفرهای در وسط رویان ظاهر میشود که بلاستوسل نامیده میشود. اتصالات شکافدار سبب میشوند سلولهای درونیتر به یک قطب کشیده شوند. در نتیجه دو دسته سلول در رویان قابل تشخیص خواهد بود که سلولهای ترفکتود
رم و سلول?های توده داخلی یا امبریوبلاست[۶] هستند (شکل۲-۱). سلولهای ترفکتودرم که سلولهای پهن پیرامونی هستند جفت و غشاهای جنینی را میسازند و سلولهای توده داخلی جنین را بوجود میآورد. آنزیم /k+ ATPase Na+ از دو زیرواحد ? و ? تشکیل شده است زیرواحد ? کاتالیتیک بوده و زیرواحد ? سبب میشود که آنزیم در موقعیت صحیح در غشا قرار گیرد [۹۷]. زیرواحد ? چهار ایزوفرم (۱?،۲?، ۳?، ۴?) و زیرواحد ? سه ایزوفرم دارد [۹]. گاهی اوقات زیرواحد سومی به نام ? با آنزیم /k+ ATPase Na+ نیز در ارتباط است [۱۷۴]. نحوه عملکرد آنزیم /k+ ATPase Na+ برای تشکیل بلاستوسیست در گونه?های مختلف متفاوت است. برای مثال برخلاف رویان گاو، رویان موش mRNAهای۲ ? /k+ ATPase Na+ و ۳? /k+ ATPase Na+ را که در غشای پایه?ای جانبی و راسی ترفکتودرم قرار می?گیرند بیان نمیکنند [۱۱۴]. اطلاعات بدست آمده از نقش/k+ ATPase Na+ در تشکیل بلاستوسیست عمدتاً از به کارگیری مهارکننده آن یعنی اوبائین۷۹ حاصل شده است [۴]. ایزوفرم ۳? در تشکیل بلاستوسیست در گاو نقش اصلی را بر عهده دارد. رویانهای گاوی نسبت به رویانهای موشی حساسیت بیشتری به اوبائین دارند و این نشان میدهد که ایزوفرم ۳? نسبت به ۱? حساسیت بیشتری به اوبائین دارد [۴]. فعالیت آنزیمی /k+ ATPase Na+ در همه گونهها درست قبل از تشکیل بلاستوسیست افزایش مییابد [۶۳].
۲-۵- آکواپورینها
آب به روشهای مختلف از میان سلولهای ترفکتودرم رویان عبور میکند که عبارتند از: ۱) انتشار ساده، ۲) انتقال تسهیل شده توسط آکواپورین۸۰ (AQP) یا کانال?های آب (شکل ۲-۲)، محصول جانبی فعالیت هم?انتقالی انتشار یک روش موثر در انتقال آب است اما بستگی به شدت شیب اسمزی دارد. ممکن است AQPها در تسهیل انتقال آب هنگام تشکیل بلاستوسیست مهم باشند [۱۲۰]. بیش از هفت mRNA، که آکواپوینها را کد میکنند در رویان موش شناسایی شدهاند. با به کارگیری مهارکنندههای AQPها مشخص شده است که AQPها نقش وظیفهای دارند [۱۴۳]. بنابراین وجود AQPهای وظیفهای در غشا ترفکتودرم عامل زندهمانی رویان موشهای فاقد ایزوفرم ۱? /k+ ATPase Na+ است. گزارش شده است که رویان موشهایی که فاقد ایزوفرم ۱?/k+ ATPase Na+ هستند میتوانند تا قبل از لانه?گزینی بدون مشکل تکوین پیدا کنند [۱۱۰]. این نتایج نشان میدهند که ممکن است در موش وجود/k+ ATPase Na+ برای تشکیل بلاستوسیست ضروری نباشد.

۲-۶- هچ یا تفریخ
مادامی که بلاستوسیست در حال تقسیمات میتوزی است مایعات به داخل حفره بلاستوسیست وارد میشوند و فشار داخل رویان افزایش مییابد و رویان به حداکثر اتساع میرسد. همزمان با رشد رویان و تجمع مایعات، آنزیمهای پروتئولیتیک توسط سلولهای ترفکتودرم تولید میشود که از درون سبب ضعیف شدن دیوار? زوناپلوسیدا میگردد. بلاستوسیست نیز با انقباضات مکانیکی خود باعث افزایش فشار درونی میگردد. هنگامی که شکاف کوچکی در زونا ایجاد میشود سلولها خود را با فشار به بیرون از زونا میکشند تا از حصار زونا آزاد شوند. در بلاستوسیست

متن کامل پایان نامه ها در سایت sabzfile.com

Leave a comment

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *