استریومیکروسکوپ بررسی میشد. پراکندگی سلولهای کومولوس معیار بلوغ موفق در نظر گرفته میشد. برای آماده سازی تخمکهای بالغ شده جهت انجام IVF، تخمکها از پتریدیش بلوغ به قطرههای ۳۰۰ میکرولیتری محیط لقاح منتقل و با جابهجایی قطره به قطره آنها، شستشو انجام میشد. سپس تعداد ۱۰ عدد اووسیت بالغ به هر قطره ۵۰ میکرولیتری از محیط لقاح منتقل و تا زمان آماده شدن اسپرم درون انکوباتور نگهداری میشد.
Washing medium
Rinsing TALP
10 ?l/ml Na Pyrovate stock
6 mg/ml BSA-Fraction V

3-1-3-2- آماده سازی اسپرم
در این پژوهش از اسپرم منجمد شده قوچ نژاد شال برای لقاح آزمایشگاهی استفاده شد. پایوتهای اسپرم از ازت خارج و در آب گرم با دمای ۳۷ درجهسانتیگراد در مدت ۱ دقیقه یخ گشایی میشدند. پس از ضدعفونی
پایوت ها با پنبه آغشته به مقدار اندک الکل، محتوای هر پایوت جداگانه درون میکروتیوبهای استریل ml 1.5 تخلیه و پس از ارزیابی میزان تحریک اسپرم، پایوتهای نامرغوب حذف میشد و سپس محتوی سایر میکروتیوبها باهم ادغام میشد. برای جداسازی اسپرمهای مرغوب، درون یک لوله فالکون ۱۵ میلی لیتری ۷۰۰ میکرولیتر پرکول ۹۰ درصد و سپس به آرامی ۷۰۰ میکرولیتر نیز پرکول ۴۰ درصد روی آن قرار داده میشد (سیلیکای کلوئیدی پوشیده با پلی وینیل پیرولیدون (PVP. سپس حداکثر ۳۵۰ میکرولیتر از اسپرم (سیمن) نیز به آرامی روی پرکول گذاشته و با دور g 700 برای مدت ۸ دقیقه سانتریفیوژ میشد. پس از اتمام سانتریفیوژ، پلت تشکیل شده به درون میکروتیوپ منتقل و پس از ارزیابی تحرک اسپرمها در زیر استریومیکروسکوپ، اسپرم هایی با تحرک بالا از پلت تشکیل شده، به هر قطره از مدیای لقاح، ۱۰۰۰۰- ۵۰۰۰ اسپرم به ازای هر تخمک اضافه می‌گردد. پتریدیشهای لقاح برای مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۹ درجه، ۸ درصد CO2 و رطوبت بالای ۹۵ درصد، قرار داده میشدند.

Fertilization TALP
10 ?l/ml Na Pyrovate stock
6 mg/ml BSA-Fraction V
10 ?g/ml Heparine

3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل ازIVF
حدود ۱۸ الی ۲۰ ساعت پس از انجام IVF، دیش لقاح از انکوباتور خارج و به منظور جداسازی اسپرمها و سلولهای کومولوس از زایگوتها، برای مدت ۳۰ ثانیه ورتکس و جنین‌ها بعد از ۴ بار شستشو در محیط H-SOF-BSA، به محیط کشت منتقل و در انکوباتور ۹ درصد CO2، با دمای ۳۹ درجه سانتیگراد و رطوبت حداکثر انکوبه می شدند.
Washing medium
HEPES SOF
5 mg/ml BSA-Fraction V

Culture media (OCM-SOF)
b-SOF or IVC SOF

3-1-5- تازه کردن۹۸محیط کشت جنین‌ها
تازه کردن محیط کشت جنین ها به طور معمول هر ۴۸ ساعت انجام می‌گیرد (روزهای ۳ و ۵) که دفعه اول آن (روز ۳) جهت جداکردن جنین های تسهیم شده از تسهیم نشده انجام می‌گیرد. ذکر این نکته ضروری است که قطرات IVM، IVF، IVCو refresh حداقل ۲ ساعت قبل از استفاده در انکوباتور قرار داده شوند.
۳-۲- تهیه محلول‌های انجمادی
تمامی محیط‌های مرتبط با روند انجماد شیشه ای در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری می شوند.
الف) محیط پایه:
محیطی که به عنوان محیط پایه در تولید تمامی محیط‌های مورد نیاز در انجماد شیشه‌ای در این مطالعه استفاده می شود، یک محیط بافری به نام PB1 است که برای ساخت آن به محیط PBS99 فاقد کلسیم ومنیزیم مقدار ۳/۳ میلی مول گلوکز، ۳۳/۰ میلی مول سدیم پیروات، ۱۰۰ واحد بین المللی به ازای هر میلی لیتر پنی‌سیلین و ۲۰ درصد FCS افزوده گردیده و پس از فیلتر کردن با فیلترهای۲۲/۰میکرومتری تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگه‌داری می‌گردد.
لازم به ذکر است زمانی که از این محیط در ساخت محلول های انجمادی و ذوب استفاده می‌شود، بایستی سرم مورد نیاز بعد از افزودن تمامی ترکیبات و در آخرین مرحله اضافه گردد.
Handling Medium (HM): H-TCM supplemented with 20% FCS

ب) محیط های انجماد:
– محیط تعدیل کننده اول
(V1):10%EG +10%DMSO dissolved in HM
– محیط تعدیل کننده دوم
(V2): 20%EG+20%DMSO dissolved in HM
گفته شده است هر چه این محیط ها کهنه تر باشند، کارآمدتر خواهند بود.
۳-۳- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای
تخمکهایی که در محیط IVM در انکوباتور گذاشته شدهاند حدود ۲ ساعت بعد از انکوباتور برداشته شده و در محیط شستشو (HM) حدود یک دقیقه قرار داده میشود و بعد به محیط V1 انتقال میدهیم و ۳۰ ثانیه در این محیط میماند و بعد به محیط V2 انتقال داده و در این محیط نیز ۳۰ ثانیه میماند و بعد بر روی کرایوتاپ گذاشته و سریع به ازت مایع انتقال داده میشود.
۳-۴- محیط ذوب
الف) Warming1(W1): HM supplemented with 1/25M Sucrose.
ب) W2:HM supplemented with 0/62M sucrose.
ج) W3: HM supplemented with 0/31M sucrose.
د) Holding medium(HM): Wash in HM

تخمکهایی که روی کرایوتاپ فریز شده را سریع از مایع ازت برداشته و در محیط W1 حدود یک دقیقه قرار داده و بعد به محیط W2 انتقال داده و در این محیط ۳۰ ثانیه میماند و بعد به محیط W3 انتقال داده و در این محیط نیز ۳۰ ثانیه میماند و در نهایت به محیط HM انتقال داده میشود و در آخر که همه تخمکها در محیط HM جمع آوری شدند را حدود ۳ با در این محیط شستشو داده و وارد محیط IVM میگردد و در این محیط ۲۴ ساعت میماند.
۳-۵- گروه های آزمایش و طراحی مطالعه
در این مطالعه تخمک ها به دو دسته کلی ۱- تخمک های منجمد- ذوب شده و ۲- تخمک های منجمد نشده تقسیم گردیدند که هریک از این دو دسته نیز دارای گروه هایی می باشند که توضیح آن در زیر آورده شده است:
۱- تخمک های منجمد
گروه آزمایشی اول: در این گروه تخمکها در مرحله GV منجمد شده و پس از ذوب به محیط بلوغ آزمایشگاهی که دارای ng1000 آلدوسترون میباشد منتقل
گردیده (و به مدت ۲۲ ساعت در این محیط باقی می ماند) و سپس مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی دوم: در این گروه تخمک ها در مرحله GV منجمد شده و پس از ذوب و طی مرحله لقاح آزمایشگاهی، در روز چهارم کشت جنینی، ng1000 آلدوسترون به محیط کشت افزوده شده و به مدت ۲۲ ساعت در محیط باقی می مانند.
گروه آزمایشی سوم: در این گروه تخمک ها قبل از انجماد، به محیط بلوغ حاوی ng1000 آلدوسترون منتقل گردیده و پس از گذشت ۲۲ ساعت، تخمک های مذکور در مرحله MII منجمد می گردند. تخمک های منجمد شده، پس از ذوب، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی چهارم: در این گروه تخمک ها بدون این که آلدوسترونی دریافت نمایند، در مرحله GV منجمد گردیده و پس از ذوب، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می نمایند
۲- تخمک های غیر منجمد
گروه آزمایشی پنجم: در این گروه بدون این که تخمک ها منجمد گردند، به محیط بلوغ آزمایشگاهی که دارای ng1000 آلدوسترون میباشد منتقل می شوند (و به مدت ۲۲ ساعت در این محیط باقی می ماند) و سپس مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی ششم: در این گروه بدون این که تخمک ها منجمد گردند، پس از طی مرحله لقاح آزمایشگاهی، در روز چهارم کشت جنینی، ng1000 آلدوسترون به محیط کشت افزوده شده و به مدت ۲۲ ساعت در محیط باقی می مانند.
گروه آزمایشی هفتم: در این گروه تخمک ها بدون این که منجمد گردیده و یا آلدوسترونی دریافت نمایند، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می نمایند.
۳-۶-ارزیابی جنین‌ها
۳-۶-۱- ارزیابی کیفی جنین‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی
رنگ آمیزی افتراقی توده سلولی داخلی۱۰۰ و سلول‌های تروفکتودرم۱۰۱همراه با شناسایی تعداد سلول مرده، در مورد جنین‌هایی که به مرحله بلاستوسیست می‌رسند، انجام می‌شود. ابتدا بلاستوسیست‌های مورد نظر به منظور شمارش تعداد سلول های مرده، به مدت ۳-۲ دقیقه در یک قطره ۱۰۰ میکرولیتری حاوی ۳۰ µg/ml پروپیدیوم یداید۱۰۲ (PI) منتقل، سپس در محیط HSOF+BSA 5mg/ml چند بار شسته شده و در قطره‌ی کوچکی از همین محیط شستشو، شمارش سلول‌های مرده زیر میکروسکوپ مجهز به سیستم فلورسنت انجام می‌گیرد.
در ادامه جنین‌ها به مدت ۱۵ ثانیه در یک قطره ۱۰۰ میکرولیتری (HSOF + 5 mg/ml BSA) حاوی ۲/۰ درصد تریتون۱۰۳قرار گرفته، سپس مستقیماً به قطره حاوی ۳۰ µg/mlپروپیدیوم یدید(PI) برای مدت زمان ۱ دقیقه منتقل و پس از آن چند بار در محیط HSOF+BSA 5mg/ml شسته می‌شوند. پس از این مرحله بلاستوسیست‌ها به داخل محیط اتانول حاوی ۱۰ میکروگرم هوخست۱۰۴، به مدت ۱۵ دقیقه در مجاورت بسته یخ منتقل می شوند. در همین مدت زمان بر روی لام با واکس پارافین دو خط موازی با فاصله ۱ سانتی‌متر قرار داده و بین آن‌ها یک قطره‌ی کوچک گلیسرول گذاشته می‌شود.
بعد از اتمام ۱۵ دقیقه جنین ها از قطره رنگ‌آمیزی خارج و در قطره گلیسرول قرار داده شده و پس از استقرار لامل بر روی آن، جنین ها به منظور مشاهده تفریقی سلول‌های تروفکتودرم (به رنگ قرمز)و توده داخل سلولی(ICM) (به رنگ آبی)، در زیر میکروسکوپ مجهز به سیستم فلورسنت مورد بررسی قرار می‌گیرند.
– HSOF + 5 mg/ml BSA + 30 µg/ml PI (30 µl/ml PI stock)
– Ice cold ethanol + 10 µg/ml Hoechst

شکل۳-۱- رنگ آمیزی افتراقی بلاستوسیت های مشتق از تخمک های منجمد، در حضور آلدسترون در روز IVM و روز چهارم IVC (به ترتیب a و b)، و بدون حضور آلدسترون (c). هسته های توده سلولی داخلی بدلیل نشاندار کردن DNA با هوخست به رنگ آبی ظاهر شده است، در حالیکه سلولهای تروفکتودرم بدلیل رنگ آمیزی DNA هسته ای با پروپیدیوم یداید نفوذ ناپذیر غشایی، به رنگ صورتی ظاهر شده است.

۳-۷- ایمونوسایتوشیمی پروتئینهای سطحی جنین های گوسفندی (Sheep embryo ICC)
1- ابتدا جنینها را از انکوباتور خارج گردیده و برای حذف محیط کشت از روی سلول ها، آنها را از دیشی که در محیط IVC قرار دارند، با پیپت پاستور استریل برداشته و با محلول PBS به آرامی جنینها شستشو داده شدند:
(ترجیحاً PBS+ 0.05% Tween-20+ 1mg/ml PVA)–(PVA: Soluble in cold water)
2- بعد از شستشو برای فیکس نمودن جنینها با پارافرمالدهید ۴%، که می بایست در دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۰ دقیقه انجام پذیرد جنینها با پیپت پاستور برداشته شده و به محلول پارافرمالدهید ۴% انتقال داده شد.
۳- حذف محلول فوق (پارافرمالدهید ۴%) از روی نمونه ها و شستشوی جنین ها با محلول PBS، ۳-۲ مرتبه (بهتر است در اولین مرحله شستشو، جنین ها به مدت ۳ دقیقه در محلول شستشو باقی بمانند) انجام گرفت.
۴- افزودن Blocking Solution (10% Sheep Serum-PBS/ BSA 10mg/ml) و سپس انکوباسیون جنین ها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق.
۵- حذف محلول بلوکه کننده از روی جنین ها (بدون این که پس از برداشت این محلول، شستشویی انجام پذیرد) و سپس افزودن آنتی بادی اولیه (Anti-Na+/K+/ATPase) در حلال آنتی بادی(آنتی بادی آماده) (۳% Sheep Serum-PBS/ BSA 10mg/ml) و انکوباسیون جنین ها در انکوباتور به مدت ۴ ساعت و سپس، به صورت Overnight در یخچال (۴ درجه) قرار گیرد.
۶- حذف محلول آنتی بادی اولیه از روی جنین ها و شستشوی سلول ها با محلول PBS، ۳-۲ مرتبه (بهتر است با محلول PBS، در سه مرحله، هر مرحله به مدت ۱۰ دقیقه شستشو شوند).
۷- حذف محلول شستشو و افزودن آنتی بادی ثانویه Sheep Anti Mouse FITC با غلظت (۲x)1:50 و انکوباسیون نمونه ها به مدت ۲ ساعت در انکوباتور (از این مرحله به بعد باید در فضای تاریک کار شود).
۸- حذف محلول آنتی بادی ثانویه از روی جنین ها و شستشو به روش گفته شده در مرحله ۶ .
۹- حذف
محلول شستشو و افزودن µg/ml DAPI/PBS 0.2 به مدت ۳-۲ دقیقه در دمای اتاق (DAPI بهتر از PI می باشد) ( در برخی گروه ها DAPI استفاده نشد).
۱۰- شستشوی یک مرحله ای جنین ها در محلول PBS و سپس اضافه کردن یک قطره گلیسرول بر روی لام و چسباندن لامل بر روی لام.
طرز تهیه آنتی بادی اولیه( (Ab Primery : ?، در هر میکروتیوپ lµ۲ آنتی بادی است که اگر به حجم lµ۴۰۰ برسد با حلال آنتی بادی، نسبت ۱:۱۰۰ حاصل میگردد.
?، در هر میکروتیوپ lµ۲ آنتی بادی است که اگر به حجم lµ۲۰۰ برسد با حلال آنتی بادی، نسبت ۱:۲۰۰ حاصل میگردد.
طرز تهیه آنتی بادی ثانویه(Ab Secondry): 1:50 با حلال آنتی بادی تهیه میشود.
در نهایت نسبتهای آنتی بادیها به این صورت Set up گردید:
?: Primery4x-Secondry4x
?: Primery2x-Secondry2x

شکل ۳-۲- رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی زیر واحد های ?۱ و ?۱ پمپ Na+/K+ ATPase . زیر واحد های ?۱ و ?۱ با فضاهایی با رنگ سبز قابل تشخیص می باشد. بیان زیر واحد ?۱ در بلاستوسیت های مشتق از اووسیت در حضور و بدون حضور آلدسترون در زمان IVM ( به ترتیب a و b)، بیان زیر واحد ?۱ در بلاستوسیت های مشتق از اووسیت در حضور و بدون حضور آلدسترون در مدتIVM ( به ترتیب c و d)، بیان زیر واحد ?۱ در بلاستوسیت های مشتق از جنین در حضور و بدون حضور آلدسترون در روز چهارم IVC ( به ترتیب e و f )، بیان زیر واحد ?۱ در بلاستوسیت های مشتق از جنین در حضور و بدون حضور آلدسترون در روز چهارم IVC ( به ترتیب g و h ).
جدول ۳-۱- ترکیبات محیط HEPES buffered M199
M199 Sigma M5017
0.475 gr
NaHCO3
0.021 gr
Na pyruvate
0.001 gr
HEPES free acid
0.1191 gr
HEPES Na salt
0.1301 gr
Pen-G
0.003 gr
Streptomycin
0.0025 gr
milli- Q water
50 ml
PH: 7.2-7.4
Osmolarity: 275-285 mosm

جدول ۳-۲- ترکیبات محیط Bicarbonate buffered M199
M199 Sigma M5017
0.475 gr
NaHCO3
0.105 gr
Na pyruvate
0.001 gr
Pen-G
0.003 gr
Streptomycin
0.005 gr
milli- Q water
50 ml
Osmolarity: 275-285 mosm

جدول ۳-۳- ترکیبات محیطIVF medium “Fert. TALP”
MilliQ Water
20 ml
NaCl
0.124 gr
KCl
0.0046 gr
NaHCO3
0.042 gr
Na2HPO4
0.0094 gr
Na Lactate(60%)
43.4 µl
CaCl2. 2H2O
0.0078 gr
Penicillin-G
0.0012 gr
Streptomycin
0.001 gr
MgCl2. 6 H2O
0.002 gr
PH: 7.3
Osmolarity: 280-290 mosm

جدول ۳-۴- ترکیبات محیطRinsing medium “R. TALP”
MilliQ Water
50 ml

متن کامل پایان نامه ها در سایت sabzfile.com

Leave a comment

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *