و همکاران، ۱۹۹۰). آزمایش مشهور پولژ و همکاران درسال ۱۹۴۹ منجر به کشف کامل خصوصیات حفاظتی گلیسرول شد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول پیشرفت عظیمی در تکنیک انجماد اسپرم بود. بعد از پی بردن به خاصیت محافظتی گلیسرول، آزمایشهای متعددی بعد از سال ۱۹۵۰ بر روی انجماد اسپرم قوچ با رقیق کنندههای حاوی گلیسرول انجام شد.
۲-۱-۴- مراحل حفظ انجمادی منی
پنج مرحله برای حفظ انجمادی منی وجود دارد:
۱- رقیق سازی و مواجه شدن با مواد محافظ انجمادی
۲- سرد کردن تا دماهای ۵-۴ درجه سلسیوس
۳- قرار گرفتن در معرض بخار ازت و سپس ذخیره سازی در ازت
۴- ذوب مجدد و قرار گرفتن در دمای اتاق
۵- حذف مواد محافظ انجمادی
۲-۲- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ
حفظ انجمادی موفقیت آمیز اسپرم تحت تاثیر عوامل مختلفی است. از جمله این عوامل می توان به رقیق کننده، مواد محافظتی موجود در آنها، روش اضافه کردن این مواد به رقیق کننده، نرخ سرد سازی و روش‌های ذوب اشاره نمود (اماموردی و همکاران، ۲۰۱۳). تلاشهای قابل توجهی برای ایجاد روشهای بهینه و ترکیب بهینهای از این عوامل جهت حفظ تحرک، سلامت و استحکام غشا بعد از انجماد-ذوب صورت گرفته است. هر کدام از این عوامل با توجه به شرایط لازم برای دستیابی به بهترین نتیجه برای باروری اسپرم بعد از انجماد-ذوب دنبال میشوند.
۲-۲-۱- رقیق کننده ها
پلاسمای منی حاوی مقادیر نسبتا بالایی از گلیکوپروتئینها، گلیکولپیدها و هورمونها میباشد. این مواد باعث محافظت از اسپرم بعد از انزال شده و انتقال اسپرم به دستگاه تناسلی ماده را تسهیل و باعث جلوگیری از ظرفیت یابی۲۶ زود هنگام اسپرم می شود. به هر حال پلاسمای منی تنها قادر است که به میزان کمی از اسپرم در مقابل صدمات ناشی از سردسازی در فرآیند انجماد- ذوب محافظت نماید. برای ذخیره سازی در دماهای پایین نیاز به رقیق کردن سیمن در رقیق کنندههای خاص میباشد. این رقیق کنندهها باید به طور کلی دارای اسیدیته، ظرفیت بافرینگ۲۷ و اسمولاریتی۲۸ مناسبی باشند و بتوانند از اسپرم در مقابل صدمات ناشی از فرآیند انجماد-ذوب محافظت کنند(سالامون و مکسول، ۲۰۰۰). در ادامه به تعدادی از این رقیق کننده ها که تاکنون مورد استفاده قرار گرفته اند به اختصار اشاره میشود.
تریس (هیدروکسی متیل آمینومتان۲۹) جزء اصلی رقیق کنندههای امروزی برای انجماد منی گاو، قوچ و سایر گونهها میباشد. این بافر دارای ظرفیت بافرینگ و اسموتیک بسیار خوبی میباشد و خاصیت سمیت آن در مقایسه با سایر بافرها کمتر میباشد. مطالعات متعدد نشان داده است که تریس به عنوان بهترین بافر برای رقیق سازی منی در اکثر گونههای پستانداران عمل می کند(سالامون و مکسول، ۱۹۹۵). بررسی مقایسهای تریس به عنوان بافر رقیق کنندهها برای رقیق سازی و انجماد اسپرم قوچ نشان داد که بافر تریس در کنار گلوکز اثرات محافظتی بهتری نسبت به سایر قندها همچون فروکتوز، لاکتوز و رافینوز دارد(شانون و همکاران، ۱۹۹۵). البته تحقیقات بیشتر نشان داد که فروکتوز هم در کنار بافر تریس اثرات بهتری نسبت به سایر قندها دارد و اسپرم منجمد شده در رقیق کنندههای بر پایه تریس، درصد بره زایی قابل قبولی را در مقایسه با سایر رقیق کنندهها نشان میدهند.سالامون و همکاران نشان دادند که رقیق کنندههای بر پایه تریس با ۲% زرده تخم مرغ، جنبایی و کلاهک آکروزم اسپرم قوچ را پس از انجماد-ذوب تا حد قابل قبولی حفظ میکند. بیشتر رقیق کنندههای تجاری امروز که برای رقیق سازی منی گاو و گوسفند استفاده میشود، بر پایه بافر تریس میباشند.
۲-۲-۳- مواد نگهدارنده یا محافظت کنندهها
۲-۲-۳-۱- مواد نگهدارنده درون سلولی یا نفود کننده
تمام روشهای انجماد سلولی بر اساس استفاده از یک یا چند ماده محافظ انجماد است. لازمه یک محافظ انجمادی، بالا بودن قدرت نفوذ و سمیت پایین۳۰ آن میباشد. گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول، عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده۳۱ هستند، که وزن مولکولی آنها نسبتا کم است. این مواد از تجمع مولکولهای آب با یکدیگر برای تشکیل کریستالهای یخ در درون اسپرم جلوگیری میکنند و برای آبگیری آب داخل سلولی ضروری هستند. همچنین نقطه انجماد پایین آنها، زمان بیشتری برای آبگیری ایجاد میکند. علاوه براین به عنوان حلال۳۲، سبب حل شدن قندهای غیر قابل حل در محیط رقیق کننده میشوند (عبدالحکیم و همکاران، ۱۹۹۱).
در طی فرآیند انجماد- ذوب، شوک سرمایی به شدت فسفولپیدهای و گلیکوپروتئینهای موجود در سطح غشا را تحت تاثیر قرار میدهد و باعث شروع آسیبهای ساختاری و بیوشیمیایی میشود. برای جلوگیری از این آسیبها علاوه بر مواد محافظ درون سلولی، به مواد محافظ خارج سلولی یا نفوذ ناپذیر نیز نیازمند است. این مواد عمدتا لیپوپروتئینها و پروتئینهای موجود در منابعی همچون زرده تخم مرغ، شیر و منابع گیاهی لسیتین سویا است. این مواد با عمل بر روی غشاء سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت میکند(سالامون و مکسول، ۱۹۹۵). استفاده از مواد محافظتی در غلظتهای پایین ممکن است که برای حفاظت از اسپرم کافی نباشد و غلظت بالای آنها نیز ممکن است که برای اسپرم سمی باشد. شرایط بهینه هر کدام از این مواد محافظ برای دستیابی به بهترین باروی در ادامه دنبال میشود. گلیسرول معمول ترین ماده محافظ انجمادی است که قادر است به درون سلول نفوذ کند(سالامون و ویزر، ۱۹۷۲). کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول توسط پولژ در سال ۱۹۴۹ تاثیر بسیار عظیمی در تکنولوژی پیچیده انجماد اسپرم داشت. خاصیت حفاظتی گلیسرول مربوط به توانایی برقراری پیوند آن با آب است و با افزایش حلالیت نمک در رقیق کنندهها باعث کاهش فشار اسمزی رقیق کننده می‌شود. افزودن گلیسرول به منی قبل از انجماد، شامل مرحله موازنه است که در طی این مرحله آب درون سلولی اسپرم بواسطه شیب اسمزی خارج شده و گلیسرول جایگزین آن میشود و بدین ترتیب مانع تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی شده و سلولها را در برابر آسیب حاصل از تشکیل کریستالهای یخ محافظت میکند.
علاوه بر گلیسرول، چندین ماده محافظ درون سلولی دیگر نیز برای انجماد اسپرم پستانداران مورد بررسی قرار گرفته است. دی متیل سولفوکساید وقتی که برای اولین بار به عنوان ماده جایگزین گلیسرول مورد استفاده قرار گرفت، باعث کاهش تحرک و زنده مانی اسپرم بعد از انجماد- ذوب شد(هولت، ۱۹۹۴). با این حال ترکیب ۵/۱ درصد دی متیل سولفوکساید همراه با ۷ درصد گلیسرول در مقایسه با رقیق کننده حاوی تنها ۵ درصد دی متیل سولفوکساید بهتر بود(سالامون و مکسول، ۱۹۹۵). غلظت ۲ درصد اتیلن گلایکول میتواند از اسپرم در فرآیند انجماد- ذوب محافظت کند و اختلاف معنی داری با رقیق کننده حاوی ۵/۳ درصد گلیسرول از نظر تحرک و زنده مانی نشان نداد. در آزمایش دیگر حضور ۵ درصداتیلن گلایکول در مقایسه با ۵ درصد گلیسرول در رقیق کننده سیمن قوچ باعث کاهش معنی داری در زنده مانی اسپرم در گروه اتیلن گردید. درصد بره زایی۳۳ در میشهای تلقیح شده با اسپرم منجمد شده در رقیق کنندههای حاوی ۵/۳ درصد گلیسرول و ۷۵/۱ درصد اتیلن گلایکول اختلاف معنی داری نشان نداد(سالامون و ویزر، ۱۹۷۲). در طول سالیان مختلف نگهدارندههای متعددی برای رقیق سازی منی پستانداران مورد بررسی قرار گرفتهاند که هیچکدام از آنها نتوانستند همانند گلیسرول عمل نمایند.
۲-۲-۳-۲- مواد نگهدارنده برون سلولی یا نفود ناپذیر
زرده تخم مرغ
از سال ۱۹۳۹ وقتی که فیلیپس و همکاران اثرات مثبت زرده تخم مرغ رابرای ذخیره سازی منی پستانداران کشف نمودند، زرده به عنوان یکی از اجزای معمول در محیط انجماد اسپرم پستاندارن مورد استفاده قرار گرفت (فیلیپس، ۱۹۳۹). زرده تخم مرغ، اسپرم را در برابر شوک سرمایی محافظت میکند. زرده در سطح غشای پلاسمایی سلول عمل میکند و نقش آن بر خلاف گلیسرول خارج سلولی است. علاوه بر اثرات مثبت زرده در طی فرآیند سرد سازی از دمای اتاق به دمای صفر درجه سلسیوس، در طی دوره انجماد نیز اسپرم از زرده برای محافظت از خود در برابر شوک سرمایی استفاده میکند. جنبایی۳۴، زنده مانی، سلامت آکروزوم و غشای میتوکندریایی اسپرم در طول استرسهای فیزیکی و شیمیایی میتواند با حضور زرده در رقیق کننده تا حد قابل قبولی حفظ شود. زرده به عنوان یک بافر اسموتیک با حضور در رقیق کننده قادر است تحمل اسپرم را به هر دو نوع محیط هایپرتونیک و هایپوتونیک افزایش دهد. ثابت شده است که اثر محفاظتی زرده تخم مرغ برای اسپرم گاو بیشتر از قوچ است (سالامون و مکسول، ۱۹۹۵).
در مورد مکانیسم دقیق اثر زرده تخم مرغ اطلاعات دقیقی در دسترس نیست و فرضیههای متنوعیدرباره این اثر وجود دارد. لیپوپروتئینهای با چگالی کم۳۵ (LDL) بخش تاثیر گذار زرده تخم مرغ است که با اتصال به غشای اسپرم در طی فرآیند انجماد-ذوب، باعث مقاومت اسپرم در برابر آسیبهای حرارتی می‌شود(واتسون و همکاران، ۱۹۷۵). به هر حال نقش کامل پروتئینها و لپیدهای موجود در LDL در برقراری پیوند و ارتباط با غشای اسپرم هنوز به طورکامل مشخص نیست. همچنین LDL حاوی مقادیری فسفاتیدیلکولین و فسفاتیدلسرین است که درطیفرآیند انجماد-ذوب به طور مرتب جایگزین فسفولیپدهای از دست رفته غشای اسپرم میشوند(گیلان و همکاران، ۲۰۰۵). فسفولپیدها میتوانند یک لایه محافظتی در اطراف غشای اسپرم تشکیل دهند. این پرده محافظتی در زمان شکسته شدن مولکولهای LDL به وجود میآید(ولنته و همکاران، ۲۰۱۰). جذب و ژلاتینه شدن آپوپروتئینهای۳۶ LDL در اطراف غشای اسپرم باعث تشکیل یک غشای محافظتی در مقابل کریستالهای یخ در اطراف غشای اسپرم شود. فرضیهای دیگر در این مورد این است که لیپوپروتئینهای با چگالی کم با پپتیدهای کاتتیونیک۳۷ موجود در پلاسمای منی برای اتصال به غشای اسپرم رقابت میکند. این پپتیدها که وزن مولکولی کمتر از ۵ کیلو دالتون دارند، میتوانند با اتصال به غشای اسپرم باعث خارج شدن کلسترول از سطح غشا شوند(موکه و همکاران، ۲۰۰۸).
غلظتهای مختلفی از زرده تخم مرغ دررقیق کنندهها برای انجماد اسپرم قوچ مورد بررسی قرارگرفته است. غلظتهای ۳ تا ۵۰ درصد زرده برای رقیق سازی منی قوچ در آزمایشهای مختلف نتایج متفاوتی داشته است. امروزه به طور کلی از غلظتهای ۱۵ تا ۲۰ درصد زرده تخم مرغ در رقیق کنندهها برای رقیق سازی منی قوچ استفاده میشود. ریتار و همکاران در آزمایشی نشان داند که درصد بره زایی در میشهای تلقیح شده با اسپرمهای منجمد شده دررقیق کننده حاوی ۳/۱ و ۱۲ درصد زرده مشابه است(روبایو و همکاران، ۲۰۸). به هر حال غلظت اپتیمم زرده در رقیق کننده منی قوچ بستگی به اجزاء تشکیل دهنده رقیق کننده دارد. گرچه زرده تخم مرغ را بعضی مواقع می توان با ماده دیگری با فعالیت مناسب جایگزین نمود، با این حال در مورد انجماد منی قوچ، زرده به واسطه خاصیت محافظتی بر روی غشای سلولی، یکی از اجزای مهم محیط انجماد است. فروزانفر و همکاران در سال ۲۰۱۰ نشان دادند غلضت زرده تخم مرغ تا میزان ۲۰ درصد و غلظت گلیسرول تا میزان ۷ درصد حجم کلی محیط انجماد، اثرات مثبتی بر روی توان حرکت اسپرم قوچ نژاد لری بختیاری پس از انجماد- ذوب دارد. با وجود اثرات بسیار مثبت زرده تخم مرغ برای رقیق سازی منی در تمامی گونه های پستانداران، در سالهای اخیر استفاده از آن با مشکلاتی روبرو شده است و تلاشهایی در جهت حذف و یا کاهش مقدار آن در رقیق کنندهها صورت گرفته است.
الف- اثرات منفی زرده تخم مرغ
با وجود اثرات بسیار مثبت زرده تخم مرغ برای محافظت از اسپرم، در سالهای اخیر پژوهشگران به دنبال راهکاری برای حذف، استخراج بخش موثر و یا کاهش مقدار زرده تخم مرغ در رقیق کنندههای منی پستانداران هستند. مهمترین بخش موجود در زرده تخم مرغ،

دسته‌ها: No category

0 دیدگاه

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *