فصل چهارم: نتـایج
۴-۱- نتایج ۳۸
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
۵-۱- بحث ۴۴
۵- ۲- نتیجه گیری ۵۲
۵-۳- پیشنهادها ۵۴
منابع ۵۵
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول ۳-۱-تجهیزات مورد نیاز برای جمع آوری، انجماد، ذوب و ذخیره منی و ارزیابیهای اسپرم ۳۱
جدول۴-۱-۲- صفات ارزیابی شده رقیق کننده حاوی سطوح مختلف لسیتین اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ۳۸
جدول۴-۱-۳- صفات ارزیابی شده رقیق کننده حاوی سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ۳۹
جدول۴-۱-۴- مقایسه ویژگی های حرکتی(مربوط به CASA) اسپرم قوچ افشاری در بین تیمارهای اختصاص یافته ۴۱
جدول۴-۱-۵- صفات ارزیابی شده رقیق کنندههای حاوی سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ۴۲
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار ۴-۱-۱ مقایسه سطوح مختلف لسیستین اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ۳۹
نمودار ۴-۱-۲ مقایسه سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ۴۰
چکیده
فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهشدما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیبهای ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم میشود که میتواند زندهمانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(۵/۰، ۱، ۵/۱ و ۲ %) و زرده تخم مرغ(۱۰، ۱۵، ۱۷ و ۲۰ %) در رقیقکننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با ۵ درصد گلیسرول) پسازفرآیند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از ۴ راس قوچ افشاری بالغ، هفتهای ۲ بار جمعآوری شد. نمونههای منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخگشایی پایوتهای حاوی اسپرم در آب گرم ۳۷ درجه سلسیوس انجام شد. تحرککلوتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازهگیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرمهای زنده و مورفولوژی اسپرمها بعد از فرایند یخگشایی اندازهگیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی ۵/۱% لسیتین و ۱۵% زرده تخممرغ در مقایسه با سایر سطوحهای آزمایشی موجب بهبود معنیدار در میزان تحرک کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگیغشا و اسپرمهایزنده شد (۰۱/۰p ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنیداری روی مورفولوژی اسپرمها نداشتند (۰۵/۰p ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن ۵/۱% لسیتین و ۱۵% زرده تخممرغ به رقیق‌کنندههای انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنیدار فراسنجههای اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرمهای زنده می?شود.
کلید واژه ها : لسیتین، رقیق کننده، اسپرم منجمد، قوچ افشاری
فصـل اول
کـلیات
۱-۱-پرورش گوسفند
پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانیمیباشد که هم اکنون ایران با داشتن ۵۵ میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کنندههای بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابیعملکرد این رقیق کنندهها با تست‌هایآزمایشگاهی مهممرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تستها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامههای اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.
۱-۲- حفظ انجماد منی
حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکیارائه میکنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب وارد میشود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد میگردد (بارباس و همکاران، ۲۰۰۹). در طول سالهای اخیر، ابداع و توسعهی انواع رقیق کنندههای منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گستردهای برای تولید رقیق کنندههایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، میتوان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچهای با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقالآسان منیاز مراکز تولید و جمعآوری به دورترین دامداریها، انجام زایشخارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونههای در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، ۲۰۰۰).
در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیبهای وارد شده به اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب تمرکز نمودهاند(تریمچ و همکاران، ۱۹۹۷: مدیروس و همکاران، ۲۰۰۲). در حالیکه، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیبها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، ۲۰۱۰: فیزر و همکاران، ۱۹۸۴ ). بیشتر ارزیابیهای آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگهای فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیهو تحلیل گستردهتری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگیغشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتینوظرفیتدارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، ۲۰۰۱).
در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی۱ به کیفیت اسپرم، محافظت کنندههای انجمادی۲ مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، ۲۰۰۰: واتسون، ۱۹۷۶). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرآیند انجماد- ذوب کاهش مییابد(سالامون و ویزر، ۱۹۷۲: بیلی و همکاران، ۲۰۰۰). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، ۲۰۰). ترکیبات موجود در رقیق کنندهها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت، ۱۹۹۷). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد حساسیت بالایی دارند، به طوریکه طی فرایند سرد شدن تنشی بر غشا اعمال شده که اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجهی این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن می‌شود(پاپا و مکاران، ۲۰۱۱). علاوه بر این، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود. بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرم با کیفیت، بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد(هولت و همکاران، ۱۹۹۲). رقیق کنندههای منی دارای خواص ویژهای هستند که موجب نگهداری طولانی تر اسپرمها میشوند. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب‌های دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرمها و در نهایت ایجادیک محیط مناسب برای زنده ماندن موقت اسپرمها نقش دارند(کری، ۲۰۰۰). گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول دارای وزن مولکولی کم بوده و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده هستند و منابع لیپوپروتیینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده تخم مرغ، شیر یا لسیتین سویا برای جلوگیری از شوک سرمایی و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(اماموردی و همکاران، ۲۰۱۳). منابع حیوانی مانند زرده تخممرغ، یک جزء طبیعی از رقیق کنندههای منی است که غشای سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمایی، در طول انجماد-ذوب محافظت میکند(واتسون، ۱۹۸۱). مکانیسم محافظتی توسط فسفولیپیدها (لسیتین) و لیپوپروتئینهای با چگالی پایین۳ انجام میگیرد(ویدسور و وایت، ۱۹۹۷: موکه و همکاران، ۲۰۰۸). مطالعات قبلی نشان داد که اسپرم قوچ میتواند در برابر شوک سرمایی، با افزودن ۱۵ درصد زرده تخم مرغ به رقیق کننده تریس محافظت شود(فیزر و همکاران، ۱۹۸۴). با این حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونیست مواد محافظ انجمادی، حاوی آلودگیهای میکروبی و خطر انتقال بیماریها، تغییرات زیاد در ترکیبات آنها، دشواری مشاهدات میکروسکوپی و سبب ظرفیت دار شدن اولیه اسپرم باشد. پروتئینهای گیاهی مانند لسیتین سویا۴، فاقد این ایرادات زرده تخم مرغ میباشند.
در چند سال گذشته رقیقکنندههای جدید حاوی لسیتینسویا برای جایگزینی زرده تخممرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، ۲۰۱۲: گیل و همکاران، ۲۰۰۳: فوکویی و همکاران، ۲۰۰۷). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیبهای وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیبهای انجمادی به اسپرم را در طی فرآیند انجماد-ذوب میطلبد.
بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (۵/۰، ۱، ۵/۱و ۲%) و زرده تخم مرغ (۱۰، ۱۵، ۱۷ و۲۰ %) و مقایسه آنها و انتخاب بهترین سطوح آنها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب میباشد.در طول سالهای اخیر، پژوهشهای بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی۵ قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرک اسپرم پس از انجماد-ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل کیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیبهای دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرمها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرمها در برابر آسیبهای انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است.
فرآیند انجماد اسپرم اکثر پستانداران مستلزم گذراندن دو مرحله میباشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن۶ نامیده میشود، دمای منی رقیق شده از دمای ۳۵-۳۰ درجه به ۵ درجه سلسیوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن میباشد، دمای منی رقیق شده از ۵ درجه به ۱۹۶- درجه سلسیوس در نیتروژن مایع کاهش داده میشود. در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی، رقیق کنندههای سرمایی به منی اضافه میگردد. این رقیق کنندهها معمولا حاوی لسیتین، پروتئینها و لیپوپروتئینهای زرده تخممرغ میباشند. در ابتدای مرحله دوم که مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ، از رقیق کنندههای انجمادی که حاوی ۷-۳ درصد گلیسرول است استفاده میشود که موجب حفظ اسمولاریته شده و ظرفیت بافری رقیق کننده را تامین میکند (دیپاز و همکاران، ۲۰۱۰: ویندسور و وایت، ۱۹۹۵). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد دارای حساسیت بالایی میباشند به طوری که در طی فرآیند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشا ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی میشود که

دسته‌ها: No category

0 دیدگاه

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *