مقاله درباره ، رويي، استخراج، رسوب، كنيم.، بافر، TE، ميكروليتر

خانواده به وی ارائه گردید.
3-7 مواد و روش ها
3-7-1 استخراج DNA
مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع در جدول 3-2 خلاصه شده است:
1666875215900جدول 3-2 مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع
00جدول 3-2 مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع

مواد نحوه ساخت مواد
کلرید سدیم اشباع 2/292گرم از کلرید سدیم را با آب مقطر به حجم 1000میلی لیتر می رسانیم .
ایزوپروپانول 100% –
اتانول 70% سرد –
بافر TE
+ Tris – base (10mM)
EDTA(1mM) ml 1 از محلول Tris-base (1M) را با ml 2/. از محلول EDTA 0.5M)) مخلوط و سپس ml 8/98 آب مقطر اضافه می کنیم .
EDTA 5/0 مولار برای تهیه ml100 از EDTA ، 612/18 گرم از آن را کشیده و در حجم ml100حل می کنیم . برای رساندن PH به 8 از بلورهای سود استفاده می کنیم .
بافرTES یا بافر لیز کننده هسته pH=(7.5)
NaCl(150mM)+
Tris-base(10mM)+
EDTA(10mM) ml 4 از محلول EDTA(0.5M) برداشته و با ml 2 از محلول Tris-base ( 1M) و ml30از محلول نمک M1 مخلوط و حجم نهایی را با آب مقطر به ml 200 می رسانیم .
SDS 10% 100گرم از سدیم دودسیل سولفات را با آب مقطر به حجم ml 1000 می رسانیم .
پروتئیناز K 1/. گرم از پروتئیناز K را در ml 10 آب مقطرسرنگ حل می کنیم و هر یک میلی لیتر آن را در میکروویال ریخنه و در فریزر نگهداری می کنیم .
3-7-1-1 چگونگی استخراج DNA
جهت نمونه گیری، از افراد مبتلا، 10-4 میلی لیتر خون جهت استخراج DNA گرفته شد. در لوله های DNA از ماده ضد انعقاد EDTA ( Ethyen Diamin Tetra Acetic Acid) 5/0 مولار استفاده شد ( به ازای 10 میلی لیتر خون 200 میلی لیتر EDTA استفاده شد).
نمونه خون (10 ميلي ليتر) را دو قسمت كرده و نيمي از آن را داخل فريزر نگهداري كرده و نيم ديگر را براي استخراج به لوله فالکون اضافه مي كنيم.
3-7-1-2 لیز سلول
به لوله حاوي خون دو برابر حجم (10 ميلي ليتر) آب مقطر سرد اضافه مي كنيم ولوله را به شدت مخلوط مي كنيم تا گلبول هاي قرمز ليز شوند و سپس به مدت 25 دقيقه با دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم.
نمونه سانتريفوژ شده حاوي رسوب گلبول سفيد وگلبول قرمز در محلول رويي است. با پيپت محلول رويي را خارج كرده تا به رسوب برسيم سپس با اضافه كردن 10 ميلي ليتر ديگر آب مقطر سرد و مخلوط كردن رسوب با آن و فيوژ كردن دوباره آن را سانتريفوژ مي كنيم .
دوباره محلول رويي (اگر محلول رويي شفاف نبود مي توانيم مرحله اضافه كردن آب مقطر سرد را ادامه دهيم تا تمام گلبول هاي قرمز پاره شوند) را از رسوب جدا مي كنيم و 5/4 ميلي ليتر از بافر ليزكننده TES به آن اضافه مي كنيم. در آن مرحله توده باز شده و سوسپانسيون صافي ايجاد مي شود (در صورت تمایل مي توان در اين مرحله كار را متوقف كرده و نمونه را در فريزر20- درجه نگهداري کنيم). 25/0 ميلي ليتر (250ميكروليتر ) از SDS 10% اضافه مي كنيم خوب لوله را سر وته مي كنيم. حال 1/0 ميلي ليتر(100 ميكروليتر ) از پروتئيناز K به آن اضافه مي كنيم و بخوبي مخلوط مي كنيم.
لوله ها را به مدت يك شب ( 3 تا 24 ساعت ) در بن ماري 37 درجه سانتيگراد يا 2 ساعت در 55 درجه سانتيگراد انكوبه مي نمائيم. اين مرحله باعث پاره شدن غشاء سلولي و هسته گشته و رشته هاي DNA آزاد مي گردد.
بعد از مدت مقرر نمونه ها را از بن ماري در آورده و 2 ميلي ليتر نمك اشباع به آن اضافه مي كنيم ( تقريباً يک سوم حجم خون مورد استفاده) و خوب تكان مي دهيم (قبل از اضافه كردن نمك اشباع مخلوط را بخوبي تكان مي دهيم).
حال نمونه ها را به مدت 30 دقيقه در دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم. در اين مرحلهDNA در مايع رويي به صورت محلول و رسوب حاوي پروتئين هاي تخريب شده مي باشد. مايع رويي را با احتياط به يك لوله ديگر اضافه مي كنيم و رسوب را دور مي ريزيم. به هر لوله به اندازه 7/0 حجم ايزوپروپانول 100 درصد اضافه مي كنيم (چون حجم لوله ما تقريباً 7 سي سي است، 5 سي سي ايزوپروپانول به آن اضافه مي كنيم). نمونه ها را به آرامي سر وته مي كنيم تا كلاف شفاف DNA ظاهر شود. الكل باعث جمع شدن و توده شدن رشته هاي DNA مي گردد. به طوري كه مي توان اين توده سفيد رنگ DNA را با چشم غير مسلح مشاهده كرد).
كلاف DNA را با كمك يك پيپت پاستور شيشه اي به يك ميكروتيوپ 5/1 ميلي ليتري منتقل مي كنيم (هرگز براي جابجايي از پيپت پاستور پلاستيكي استفاده نمي كنيم چون پيپت پلاستيكي بارمثبت دارد و DNA بار منفي، بنابراين جذب يكديگر شده و ديگر جدا نمي شوند).
نمونه را به مدت 30 ثانيه در دور 8000 ميكروفيوژ مي كنيم. محلول رويي را دور ريخته و به كلاف DNA كه در لوله رسوب كرده است 1 ميلي ليتر الكل اتانول 70 درصد سرد اضافه مي كنيم و لوله ها را تكان مي دهيم تا DNA شستشو داده شود. سپس نمونه رابه مدت 30 ثانيه با دور 8000 ميكرو فيوژ مي كنيم. مايع رويي را دور ريخته و دوباره 1 ميلي ليتر الكل اتانول 70 درصد سرد به آن اضافه مي كنيم وآن را تكان مي دهيم و سپس با دور بالا ميكروفيوژ مي كنيم. سپس مايع رويي را دور ريخته و با نوك سمپلر الكل باقي مانده را از روي كلاف بر مي داريم و به مدت نيم ساعت در مجاورت هواي آزمايشگاه قرار مي دهيم تا الكل باقي مانده تبخير شود.
3-7-1-3 هیدراسیون DNA
به رسوب حاصل حدود 50 تا 200 ميكروليتر (بر حسب ميزان توده DNA ) بافر TE اضافه مي كنيم .DNA در بافر TE به صورت محلول در مي آيد (يك شب در دماي اتاق انكوبه مي شود).
اين DNA آماده PCR بوده و قابليت سال ها نگهداري در يخچال را دارد. شستن نمونه با اتانل70% جهت برداشت نمك هاي باقي مانده مي باشد. بايد توجه داشت كه اگر مقداري اتانل همراه DNA باقي بماند، DNA حاصل در PCR تكثير نمي شود و همچنين بايد مواظب بود تا DNA بيش از اندازه خشك نشود چون در مرحله بعدي در بافر حل نمي شود. يكي از مشكلات ممكن در PCR ناشي از وجود بافر TE حل كننده DNA است كه مي تواند به نحو موثري غلظت Mg2+ را از طريق EDTA شلاته كننده، كاهش داده و PCR را مهار نمايد. به نحو مشابهي DNA استخراج شده مي تواند محصولات تجزيه را هم به همراه خود داشته باشد كه با PCR تداخل نمايد. SDS نيز در ميزان بيشتر از 10 درصد مهار كننده PCR مي باشد و بايد توسط استخراج و رسوب الكلي برداشته شود.
3-7-2 تعيين غلظت DNA استخراج شده
به منظورارزيابي كميت و كيفيت DNA و آگاهي از ميزان غلظت و خلوص آن مي توان از روش اسپكتروفتومتري استفاده كرد. يعني ميزان جذب اشعه UV توسط بازهاي DNA را اندازه گرفت كه روش ساده و دقيقي مي باشد. مولكول هاي DNA به علت حضور بازهاي آروماتيك آدنين، گوانين، سيتوزين و تيمين داراي جذب نوري زياد در محدوده ماوراء بنفش مي باشند. بنابراين اندازه گيري جذب نوري محلول هاي DNA شاخص خوبي براي درجه خلوص آن مي باشد.
حداكثر جذب مولكول DNAدر طول موج 260nm است. از طرفي معمولاً محلول هاي DNA مقداري آلودگي پروتئيني دارند كه حداكثر جذب محلول هاي پروتئيني نيز به علت حضور اسيدهاي آروماتيك مانند فنيل آلانين، تيروزين، تريپتوفان در طول موج 280nm مي‌باشد. بنابراين نسبت جذب در طول موج ها 260/280 را مشخص مي کنند. جذب نوري (OD) معيار مناسبي براي تعيين نسبت Protein/DNA در يك نمونه و به عبارتي درجه خلوص خواهد بود. به همين علت جهت تعيين غلظت DNA محلول، بايد جذب آن را در طول موج هاي 260nm و 280مشخص نمود. OD خوانده شـده در 260nm نشان دهنده غلظت DNA در محلول و OD در طول موج 280nm نشانه مقـدار آلـودگي با پروتئين است. نسبت 260/280 OD محـاسبه مي گردد و هرگاه اين نسبت داراي ميانگين 8/1 (2- 7/1) باشد حاكي از خلوص خوب DNA است. بهترين نسبت 2 مي باشد و در صورت آلودگي زياد با پروتئين مانند هم (Heme) يا مواد آروماتيك مانند فنل، اين نسبت به طور چشمگيري كاهش مي يابد (نسبت بيش از 2 احتمال آلودگي با RNA را نشان مي دهد).
3-7-2-1 روش تعيين غلظت DNA:
محلول DNA را با استفاده از محلول TE رقيق مي كنيم. 5 ميكروليتر از محلول DNA را با 95 ميكروليتر از محلول TE مخلوط مي كنيم. براي كاليبره كردن دستگاه از 100 ميكروليتر TE به عنوان بلانك استفاده می شود. سپس جذب نوري را در طول موج 260 و280 نانومتر می خوانيم. نسبت اين جذب در هر مورد محاسبه می شود. این نسبت براي تمامی نمونه های DNA در این بررسی، بين 7/1 تا 9/1 بود كه كيفيت خوب DNA را نشان مي دهد. دستگاه غلظت DNA را هم به ما نشان مي دهد.
3-7-2-2 نحوه خالص سازي نمونه هاي آلوده به پروتئين
روش کار شامل مراحل زیر می باشد:
به حجم كل ميكروتيوب به ميزان 300 ميكرو ليتر از محلول TES اضافه و مخلوط مي كنيم.
18 ميكروليتر از SDSبه آن اضافه و مخلوط می کنیم. سپسµl3 آنزيم پروتئيناز K اضافه مي نمائيم.
به مدت 2 ساعت يا يک شبانه روز نمونه را در بن ماري37 درجه سانتي گراد انكوبه مي نمائيم.
پس از اتمام انكوباسيون، 220 ميكروليتر از محلول نمك اشباع اضافه و 5 دقيقه سانتريفوژ(rpm 12000) مي کنيم.
محلول رويي را جدا می کنیم و به آن 550 ميكرو ليتر ايزوپروپانل مي افزائيم. پس از ديدن كلاف DNA آن را جدا می کنیم و مراحل شستشو با اتانل 70 درصد را انجام مي دهيم. پس از تبخير الكل به مقدار كافي به آن بافر TE می افزائیم و اجازه می دهیم تا DNA هيدراته شود.
3-7-3 آنالیز پیوستگی برای بررسی 7 جایگاه ژنی مرتبط با ناشنوایی اتوزومی مغلوب غیرسندرمی
در این class=’link’>6

  • 7
  • متن کامل در سایت homatez.com