سامانه پژوهشی – مطالعه تجربی و مدلسازی ریاضی خشک کن آنالیز بیان چندین ژن مهم در …

تنش خشکی بر متابولیسم قندها در گیاهان تأثیر میگذارد. قندها به صورتهای گوناگون در بردباری به خشکی در گیاهان شرکت میکنند. قندها میتوانند به عنوان متابولیتهای سازگار یا اسمولیتها سبب تنظیم اسمزی شوند. همچنین سبب پایداری غشا و پروتئینهای در حال خشک شدن میگردند، بدین صورت که تثبیت غشاء از طریق جایگزین شدن آب موجود در غشای لیپیدی دو لایه صورت میگیرد و به این ترتیب از متراکم شدن فسفولیپیدها جلوگیری کرده و همچنین از پیوندهای نابجا بین پروتئینهای غشایی جلوگیری میکنند. پایدارسازی پروتئینها نیز از طریق تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین گروههای کربوکسیل قند و زنجیرههای قطبی پروتئین صورت میگیرد .(Ingram and Bartles, 1996)تجمع بیش از حد قند در بسیاری از گونههای گیاهی در معرض شوری، خشکی و UV-B گزارش شده است (Ranjbarfordoei et al., ۲۰۰۹ ؛Musil et al., ۲۰۰۲). چنین افزایشی به آسیب میتوکندریایی را می توان به کاهش مصرف انرژی تنفسی نسبت داد که برای انباشتگی نشاسته مطلوب میباشد. طبق نظر کارشناسان انباشتگی سلولی نشاسته، میتواند طی چندین مکانیسم همانند:
قطع فیزیکی عملکرد کلروپلاست
بازدارندگی فیدبکی فتوسنتز در اثر کاهش فعالیت روبیسکو
محدودیت فسفات غیرآلی
بازدارنده فتوسنتز باشد و این ممکن است تولید بیومس را کم کند (He et al., ۱۹۹۴). تحقیقات متعددى در زمینه نقش کربوهیدراتهاى محلول و افزایش آنها تحت شرایط تنشهاى گوناگون صورت پذیرفته است که همگى بر نقش ترکیبات مذکور در تنظیم اسمزى سلول دلالت دارند .(Wu and Garg, 2003)
۱-۳ کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان
۱-۳-۱ اثر تنشهای محیطی در فرایندهای مولکولی در گیاهان
گیاهان در پایدار نگه داشتن محیط زمین نقش مهمی ایفا مینمایند. آنها در طول دوره بلند مدت تکامل و گسترششان، مکانیسمهای پیشرفتهای را برای پاسخدهی به تغییرات محیطی اختیار نمودهاند. این مکانیسمها در بسیاری از جنبههای آناتومی، فیزیولوژی، بیوشیمیایی، ژنتیک، رشد و نمو، تکامل و زیست مولکولی دخیل بوده (Shao et al., ۲۰۰۷a) که نهایتاً طبیعتشان به بیان ژن در سطح مولکولی برمیگردد (Shao et al., ۲۰۰۷b). در محیطی با تغییرات مداوم، شرایط بسیار سخت تنشزا همانند سرما، خشکی، شوری و UV-B (280-320nm) وجود داشته که رشد گیاهی و محصولدهی را بشدت تحتﺗﺄثیر قرار میدهند. پاسخهای مولکولی به یک چنین تنشهای محیطی طی چند سال گذشته به میزان زیادی مورد مطالعه و بررسی قرارگرفته و ثابت شده است که یک شبکه پیچیده درمسیر علامترسانی وجود دارد که علائم تنش محیطی را درک، پیامبر ثانویه را تولید و انتقال علامت را کنترل مینماید۲۰۰۳) Shinozaki et al.,). هورمونهای گیاهی در این شبکه انتقال، مکان مرکزی را اشغال نموده و غالباً در ارتباط دادن بین سایر علائم فعالیت میکنند تا بطور هماهنگ، فرایندهای سلولی را که اساس رشد و نمو گیاهان عالی و همچنین بیان ویژگیهای منحصربهفردشان است، تنظیم نمایند (Casati and Walbot, 2004). سلولهای گیاهان عالی دارای گیرندهها، کانالها، Gپروتئینها و کینازها در غشاهای ویژه خود هستند. برخی از کمپلکسهای پروتئینی علامترسان غالبتراند نظیر سیگنالوزوم [۲۳]COP6 که نسبتاً پایدار بوده و شاید همواره در حال سنتز باشند. سایر کمپلکسهای پروتئینی احتمالاً افمرال[۲۴]بوده و در نتیجه علامتدهی تشکیل میشوند (Shao et al., ۲۰۰۷b). در گیاهان اشکال القاءکننده تنش زیستی و غیرزیستی، برخی از مسیرهای علامترسانی و پاسخگویی مشترک با یکدیگر دارند ( Chinnusamy et al., 2004؛Shao et al., ۲۰۰۵) بنابراین از طریق تاثیر متقابل می توانند اثرات خود را تعدیل نمایند (Shao et al., ۲۰۰۵).
ژنهای القا شده توسط تنش محیطی بهطورکلی از لحاظ تولیدات پروتئینیشان به دو نوع تقسیم میشوند:
۱-ژنهایی که محصولات کد کنندهشان سلولهای گیاهی را مقاوم به تنش محیطی میکنند، نظیر پروتئین LEA.، پروتئینهای ضد یخ، پروتئینهای تنظیمکننده اسمز، آنزیمهای سنتز کننده بتائین، پرولین و سایر تنظیم کنندگان اسمزی.
۲- ژنهایی که محصولات کدکننده آنها درتنظیم بیان ژن و انتقال علامت ((Signal transduction نقش مهمی بازی میکنند، نظیر عناصر رونویسی برای احساس و انتقال پروتئینکینازهای MAP،CDP، Bzip،MYB و غیره (Shao et al., 2007b). پیشرفتهای اخیر در زمینه زیست شناسی مولکولی (مخصوصاً DNA microarray)، ژنومیکس، پروتئومیکس و متابولویکس، دیدگاههایی به سمت سیستم شبکهای تنظیم ژن در گیاهان بدست داده است که اساساً متشکل از ژنهای قابل القا، عناصر تنظیمی و کنترلی بیانشان (cis-element و trans-element)، مسیرهای بیوشیمیایی و عوامل گوناگون علامتیاند Wang et al., 2003)؛ .(Zhu et al., ۲۰۰۳هدف از استراتژی مهندسی ژنتیک گیاهی که به تازگی بنیان نهاده شده است نیز بر پایه عناصر رونویسی بوده که ویژگی مقاومت را در گیاهان بهبود میبخشد (Puhakainen et al., ۲۰۰۴).
شکل-۱-۶ – عملکرد ژنهای القایی در تحمل و پاسخ به تنش. محصولات ژن به دو گروه طبقه بندی میشوند. گروه اول شامل پروتئینهایی است که احتمالا در تحمل به تنش عمل میکنند (پروتئین های عملکردی)، و گروه دوم شامل فاکتورهای پروتئینی درگیر در تنظیم بیشتر Signal transduction و بیانژن که احتمالا در پاسخ به تنش عمل میکنند (پروتئینهای تنظیمی) ( Shinozaki and .(Yamaguchi-Shinozaki۲۰۰۷
تنشهای غیرزیستی اغلب در قالب خشکی، سرما، یخ زدگی، گرما ، شوری ، کمبود مواد غذایی و تنش مکانیکی رخ می دهند. تنشهای محیطی هرگز بهتنهایی عمل نمیکنند با این وجود، مطالعات آزمایشگاهی اغلب به پاسخ گیاهان به فاکتورهای تنشی مجزا محدود میشوند (Shao et al., ۲۰۰۷a). با وجود پژوهش‌های انجام گرفته در تشخیص برخی از ژن‌های مرتبط با تنش و مسیرهای سیگنال‌دهی‌ آن، دانش ما از سازگاری گیاه به تنش‌های غیرزنده همچون خشکی، شوری، دمای غیربهینه و خاک دچار کمبود مواد غذایی، محدود است. بنابراین مهندسی مقاومت به خشکی در گیاهان از اهمیت اقتصادی فوق العادهای برخوردار است. برای توسعه استراتژیهای جدید بدین منظور یکی از مهمترین اهداف تحقیقات درک مکانیزمهای مولکولی سهیم در مقاومت به خشکی گیاهان میباشد. خشکی پاسخ‌های گوناگون و زیادی را در گیاهان برمیانگیزد که این پاسخها شامل تغییرات در تظاهر ژن، تجمع متابولیت‌هایی مانند هورمون‌های گیاهی، اسید آبسزیک یا ترکیبات فعال اسمزی و سنتز هورمونهای خاص میباشد. که از جمله اینها میتوان پروتئینهای بسیارآبدوست، پروتئینهایی که رادیکالهای اکسیژن را جذب میکنند، پروتئینهای چپرون و غیره را نام برد Ramachandra et al., 2004)). اعتقاد بر این است که آنتیاکسیدانها، پروتئینهای تنظیمشونده با کلسیم و پروتئینکینازها پس از دریافت تنش، در ترارسانی آبشاری جهت فعالسازی مسیرهای دفاعی و سازش دخیل میباشند. با پیشرفت تکنولوژی میکروسکوپی DNA که اجازه آنالیز زیادی را از تظاهر RNA پیغامبر میدهد چند صد ژن القاشده توسط تنش و استرس به عنوان ژنهای مسئول مقاومت به خشکی برای مهندسی ژنتیک مشخص شده است. از میان ژنهای مشخص شده چندین مورد به عنوان ژنهای تنظیم کننده معرفی شدهاند.
با وجود اینکه رویکردهای مرسوم در اصلاح و فیزیولوژی گیاهان اهمیت بسیار زیادی دارد، مهندسی ژنتیک ژنهای تنظیمکننده اصلی که مقاومت به خشکی و ژنهای مرتبط با مقاومت به خشکی را مدیریت مینمایند یکی از مهمترین استراتژیها برای دانشمندان در به حداقل رسانیدن تاثیرات منفی همراه با خشکی به شمار میرود Vinocur et al., 2005) ).
۱-۳-۲ مسیرهای ژنهای کنترلکننده تنشهای غیرزنده
هورمون [۲۵]ABA که تحت شرایط کمآبی تولید میشود نقش مهمی در تحمل به خشکی گیاهان دارد. بر همین اساس مسیرهای اصلی پاسخ به خشکی در گیاهان به ۲ مسیر وابسته به ABA و مستقل از ABA تقسیم شدهاند. بررسی بیان ژنهای القا پذیر به وسیله تنش در گیاه آرابیدوپسیس نشان داده که حداقل ۴ سیستم تنطیمی مستقل برای پاسخ به تنش وجود دارد که عبارتند از : ۱- تنظیمکنندهDREB 2- تنظیمکننده NAC و ZF-HD 3- تنظیمکننده AREB-ABF 4-تنظیمکننده MYC و MYB. تنظیمکنندهDREB ، NAC و ZF-HDمستقل از آبسزیک اسید هستند که به تیمار اسید آبسزیک و سرما پاسخ نمیدهند. تنظیمکنندههای MYC و MYB و AREB-ABF وابسته به اسید آبسزیک هستند. با کنترل بیان سیستم تنظیمکنندهها، امید میرود که تحمل گیاهان به تنشهای محیطی را بهبود داد (Nakashima et al., ۲۰۰۵).
شکل-۱-۷- شبکههای تنظیمی بیان ژنهای القا پذیر به وسیله تنشهای محیطی .(Nakashima et al., ۲۰۰۵)
۱-۴ ژنهای مورد مطالعه
۱-۴-۱ پروتئین‌کینازها
پروتئینکیناز آنزیمی است که با افزودن گروه فسفات (فسفوریلاسیون) به پروتئین‌ها در آن‌ها تغییر ایجاد می‌کند. معمولاً فسفوریلاسیون با تغییر فعالیت آنزیمی، موقعیت سلول و یا همکاری با دیگر پروتئین‌ها باعث تغییر در عملکرد پروتئین هدف (سوبسترا) می‌گردد. ژنوم انسان حدوداً دارای ۵۰۰ ژن پروتئینکیناز است. پروتئینکینازها همچنین در باکتری‌ها و گیاهان نیز یافت شده‌اند (Manning and Whyte, 2002). فعالیت شیمیایی یک کیناز به‌صورت انتقال یک گروه فسفات از ATP با ایجاد پیوند کووالانت با یکی از سه اسیدآمینه‌ای (سرین[۲۶]، ترئونین[۲۷] و تیروزین[۲۸]) که یک گروه هیدروکسیل آزاد دارند، انجام می‌گیرد (Dhanasekaran and Premkumar, 1998).
وضعیت فسفوریلاسیون پروتئین‌ها می‌تواند اثرات زیادی روی فعالیت آن‌ها و برهمکنش با دیگر پروتئین‌ها داشته باشد. نزدیک به ۱ تا ۳% از ژن‌های یوکاریوت‌ها، رمزکننده پروتئین‌کینازها هستند که نشان می‌دهد، آن‌ها در خیلی از جنبه‌های تنظیم سلولی و متابولیسم درگیر هستند. در گیاهان، فسفوریله شدن پروتئین، در پاسخ به سیگنال‌های مختلف شامل نور، هجوم پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، تنش و فقدان مواد غذایی ضروری است ((Stone and Walker, 1995.
شکل-۱-۸- فسفوریلاسیون پروتئین (Dhanasekaran and Premkumar, 1998).
هانکس و هانتر در سال ۱۹۹۵ پروتئین‌کینازها را به پنج گروه اصلی طبقه‌بندی کردند (Hanks and Hunter, 1995):
۱) گروه AGC شامل خانواده وابسته به نوکلئوتید حلقوی (PKG[29] و [۳۰]PKA)، خانواده [۳۱]PKC و خانواده S6 کیناز ریبوزومی. این گروه شامل کینازهای وابسته به نوکلئوتید حلقوی و کینازهای وابسته به فسفولیپید کلسیم است.
۲) گروه [۳۲]CaMK. این گروه از پروتئینکینازها شامل خانواده پروتئینکینازهای وابسته به کلسیم/کالمودولین هستند و با SNF1/AMP فعال می‌شوند.
۳) گروه CMGC شامل خانواده [۳۳]CDK، MAPK[34]، [۳۵] GSK3و [۳۶]CKII. تمام این چهار خانواده در گیاهان شناخته شده‌اند. برخلاف گروههای AGC و CaMK، تنظیم شدن فعالیت پروتئینهای این گروه با پیامبر ثانویه نمیباشد و به صورت فسفریلاسیون آبشاری در فرودست (down stream) تنظیم میشوند.
۴) گروه PTK[37]. یک خانواده مهم از تنظیم‌کننده آنزیم‌ها در یوکاریوت‌های عالی هستند. این خانواده از پروتئینکینازها مخصوص فسفریله کردن تیروزین هستند.
۵) دیگر گروه‌ها. اغلب پروتئینکینازهای کلون شده در گیاهان که در چهار گروه قبلی جا نمی‌گیرند، دراین دسته طبقه‌بندی
می‌شوند. پروتئینکینازهای شایع در یوکاریوت‌ها، [۳۸]RLKs و [۳۹]Tsl در این گروه جای می‌گیرند.
۱-۴-۲ خانواده ژنیMAPK
گیاهان اغلب در طول رشد و نمو خود تحت تاثیر تنشهای مختلفی قرار گرفته و ژنهای دفاعی آنها در فرایند پاسخ به تنش درگیر هستند. فسفریلاسیون/دفسفریلاسیون پروتئین یک مکانیسم تنظیمکنندگی در کنترل فعالیت این ژنهای دفاعی است. آبشار پروتئینکیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مهمترین مسیرهای فسفریلاسیون بوده که در پائین دست سنسورها/رسپتورها عمل میکند و پاسخهای سلولی را نسبت به محرکهای داخلی و خارجی تنظیم میکند (Wang et al., ۲۰۰۷). آبشار پروتئینکیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مسیرهای مهم در سلولهای یوکاریوتی بوده بهطوریکه در پاسخ به محرکهای خارج سلولی فعال میشود (Xiong et al., ۲۰۰۶). خانواده MAPK در پاسخ به انواع زیادی از محرکهای خارج سلولی از جمله: پاتوژنها، خشکی، شوری، سرما، ازن (O3)، گونههای فعال اکسیژن، محرکهای هورمونی میتواند فعال شود (Jonak et al., ۲۰۰۲). MAPK میتواند انواعی از سوبستراها از جمله فاکتورهای نسخه برداری، سایر پروتئینکینازها و پروتئینهای مرتبط با اسکلت سلولی را فسفریله کند (۲۰۰۵ Nakagami et al.,).
MAPKها سرینها و ترئونینهای اختصاصی سوبسترای پروتئین هدف را فسفریله کرده و فعالیتهای سلولی اعم از بیان ژن، میتوز، جنبش، متابولیسم و مرگ برنامهریزی شده را تنظیم میکنند. کاتالیز فسفریلاسیون در پروتئینهای سوبسترا توسط MAPK به عنوان یک سوئیچ برای خاموش یا روشن کردن فعالیت پروتئین سوبسترا عمل میکند. سوبسترا شامل سایر پروتئینکینازها، فسفولیپازها، فاکتورهای رونویسی و پروتئین های اسکلت سلولی میباشد. پروتئینفسفاتازها فسفات هایی را که توسط MAPK به سوبسترای پروتئینی منتقل شده است حذف میکنند. یک آبشار MAPK معمولی شامل سه مرحله است:
یک MAP کیناز کیناز کیناز (MAPKKK) یک MAP کیناز کیناز (MAPKK) اختصاصی را از طریق فسفریلاسیون در دو باقیمانده سرین/ ترئونین در یک موتیف حفاظت شده S/T-X3-5-S/T فعال میکند، MAPK فعال شده به نوبهی خود میتواند یک MAPK را در باقیماندههای ترئونین و تیروزین در توالی ثابت TXY فسفریله کند. گیاهان نسبت به سایر یوکاریوتها مجهز به تعداد بیشتری از ژنهای کدکنندهی MAPKاها میباشند. به طور مثال، مخمر دارای ۶ ژن کد کنندهی پروتئینهای MAPK، پستانداران دارای ۱۳ تا، گیاه آرابیدوپسیس دارای ۲۳ و برنج دارای ۱۵ تا هستند. تا امروز بیش از ۶۰ MAPK در گیاهان شناخته و جدا شده است و آنالیز توالیهای ژنومی آرابیدوپسیس وجود بیش از ۲۰ ژن MAPK را مشخص کرده که نشان میدهد آبشار MAPK در گیاهان ممکن است کاملا پیچیده باشد.
شکل-۱-۹- درخت فیلوژنتیکی MAPK های آرابیدوپسیس با سایر گونه های گیاهی (Jonak et al., ۲۰۰۲).
بر اساس آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسید و فسفریلاسیون موتیف، MAPKهای گیاهی حداقل به چهار گروه (D, C, B, (A تقسیم میشوند. در بین آنها، گروههای A و B تقریبا” در سیگنالینگ تنشهای زیستی و غیرزیستی مثل سرما، خشکی، زخم، حمله پاتوژن و هورمونها درگیر هستند. اطلاعات محدودی در مورد MAPK های گروه C در دسترس بوده و به نظر میرسد که بعضی از آنها در تنطیم چرخهی سلولی و برخی در پاسخ به تنشهای محیطی دخیل هستند. همهی MAPKهای گروه D بجای موتیف TEY دارای موتیف TDY بوده که در زیرگروههای A و B و C حفاظت شده است. علاوه بر این، آنها دارای یک دمین الحاقی C- ترمینال طولانی میباشند. گزارش شده است که دو عضو این گروه، OsBWMK1 و MsTDY1، میتوانند توسط حمله پاتوژن و زخم مکانیکی فعال شوند. حقایق فوق نشان میدهند که MAPKها نقش حیاتی را در رشد و نمو گیاه بازی میکنند. به منظور به دست آوردن اطلاعات بیشتر درباره الگوهای ساختاری و تنظیم اختصاصی MAPKها، جداسازی و توصیف ژنهای بیشتر MAPK از گونههای مختلف ضروری میباشد. خصوصیات مولکولی و بیوشیمیایی ژنهای MAPK در گیاهان بطور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته است، اما بسیاری از این مطالعات در گونههای مدل گیاهی مانند آرابیدوپسیس، تنباکو و برنج انجام شده است. در گیاهان، MAPKها نه تنها به وسیلهی فسفریلاسیون پس از ترجمهای بلکه توسط کنترل نسخه برداری نیز فعال میشوند، در حالیکه در مخمر و پستانداران فقط به وسیلهی مسیر اول فعال میشوند. مطالعات بیشتر در سالهای اخیر نشان داده است که فعالیت نسخه برداری ژنهای MAPK گیاهی رایجتر میباشد. به طور مثال، ATMPK3 در آرابیدوپسیس و MMK4 در یونجه، هر دو تجمع mRNA را تحت تنشهای خشکی و سرما نشان میدهند .(Wang et al., ۲۰۰۷) بسیاری از اطلاعات بدست آمده در مورد وظایف احتمالی MAPKها در سلولهای جانوری و گیاهی از مطالعه روی این آنزیمها بدست آمده است. MAPKها برای ورود مجدد به چرخهی سلولی از هر دو فاز G1 و G2 مورد نیاز هستند. MAPKهای تحریک شده توسط فاکتورهای رشد با تاثیر بر روی بیان سیکلین اختصاصی-G1 اثرات خود را اعمال میکنند. مسیر MAPK در دو نقطه در طول تقسیم سلولی میوز در قورباغه زنوپوس مورد استفاده قرار میگیرد:
برای شروع بلوغ اووسیت ها در میوز I که در مرحله ی G2 توقیف شدهاند و برای ایجاد وقفه در پیشرفت چرخهی سلولی در یک مرحلهی متافاز مانند در انتهای میوز II.
شواهد فراوانی در مورد فعالیت میتوزی خاص MAPKها در سلولهای جانوری وجود دارد. اگرچه، به نظر میرسد MAPK برای میتوز طبیعی در عصارههای سلولی زنوپوس غیرضروری است، اما برای نقطهی بررسی صحت میکروتوبول در طول میتوز لازم است.MAPK ها جنبههای متعددی از وظایف میکروتوبول را در هر دو تقسیم میتوزی و میوزی سلولهای جانوری تنظیم میکنند. یافتهها نشان میدهند که MAPKها به خاطر فسفریله کردن پروتئینهای وابسته به میکروتوبول و تنظیم دینامیک میکروتوبول با میکروتوبولها در ارتباط هستند. با استفاده از آنتیبادیهای اختصاصی برای MAPKهای فعال، محققین [۴۰]ERK1 و ERK2 را در ساختارهای مختلف میتوزی شناسایی کردهاند، که در کینتوکورها زمانی که برخی از کروموزومها در فرایند همترازی (alignment)، در سانتروزومها در سراسر مرحله میتوز شرکت میکنند، و در جسم میانی در طی سیتوکینز، وجود دارند. بنابراین، ERK1 و ERK2 در چندین مرحله در طول تقسیم میتوزی نقش دارند (Bögre et al., ۱۹۹۹). MAPKهای گیاهی بیشترین همولوژی را با زیر خانواده ERK دارند (Jonak et al., ۲۰۰۲).

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  fotka.ir  مراجعه نمایید.