مطالعه تجربی و مدلسازی ریاضی خشک کن آنالیز بیان چندین ژن مهم …

افرایش میزان mRNA MAP کیناز ۱ (MMK1) در فاز G2 چرخهی سلولی سلولهای یونجه نشان میدهد که این MAPK احتمالا در کنترل چرخهی سلولی دخیل میباشد، اما مشخص نشده است که آیا این MAPK در این سلولها نیز فعال است. میزان بالای بیان MEKK ,NPK1 توتون در تکثیر سلولها نیز به امکان دخالت در کنترل چرخهی سلولی اشاره دارد. همچنین یافت شده است که(Nicotiana Protein Kinase 1) NPK1 در یک مسیر سیگنالی که بیان ژن القاء شده توسط اکسین را مهار میکند، دخالت دارد. .(Bögre et al., ۱۹۹۹)
۱-۴-۳ ژن حساس به اکسین
هورمونها مولکولهای سیگنالی سیستمیکی هستند که نقش کلیدی را در رشد و نمو گیاهان بازی میکنند. آنها همچنین در شکلگیری رشد و نمو در پاسخ به علائم محیطی از قبیل نور درگیر هستند (Liscum and Reed, 2002). اکسینها اولین هورمونهای گیاهی کشف شده و ایجاد کننده سیگنالهای مهم در تکامل و رشد گیاهان هستند. اکسین در جوانهها، برگها و میوههای در حال رشد ساخته میشود. ممکن است مقداری اکسین در ریشه نیز ساخته شود اما بیشترین میزان اکسین در جوانه انتهایی گیاه ساخته و به دو شکل فعال و غیر فعال به سایر قسمتهای گیاه انتقال مییابد et al., ۲۰۰۶) .(Gururaj
 
شکل-۱-۱۰ مسیر سیگنالینگ اکسین (Liscum and Reed, 2002).
اکسینها تنظیمکنندههای رشد گیاه هستند که چندین فرایند در رشد و نمو گیاه از جمله تقسیم سلولی، طویل شدن سلول، قطبیت سلولی و تمایز سلولی را کنترل میکنند. اکسینها اعمال بینظیری در بافتهای مختلف دارند. به عنوان مثال آنها میتوانند سبب تحریک طویل شدن ساقه، القای تشکیل ریشه جانبی، مهار رشد جوانه جانبی یا تحریک تمایز رشتههای آوندی شوند. تنوع عملکردی اکسین نشان میدهد که گیاهان دارای چندین مکانیسم برای درک و پاسخ به این هورمونها بوده و سلولهای مختلف زیر مجموعهها و مقادیر مشخصی از اجزای پاسخدهی و درککننده اکسین را دارا میباشند (Walker (and Estell, 1998 . اخیرا بهطور چشمگیری، گزارش شده است که اکسین به طور گستردهای به عنوان تنظیمکننده رشد گیاه شناخته شده و همچنین در پاسخ به تنش شرکت میکند. بیشتر علائم مشاهده شده در گیاهان آالوده یا تحت تنش کاهش رشد و تغییر متابولیسم را نشان میدهند. علاوه بر این، ژنهای تنظیم شده با اکسین در گیاهان آلوده به پاتوژن تحت تاثیر قرار میگیرند. این مشاهدات پیشنهاد میکند که اکسین در سازگاری گیاهان به تنشهای زیستی و غیرزیستی دخیل میباشد .(Park et al., ۲۰۰۷)
Genetics
Environment
Hormones and Growth Regulators
Growth and Development
شکل-۱-۱۱- رشد گیاه توسط هورمونها وتنطیمکنندههای رشد تنظیم میشود.
رشد و نمو طبیعی گیاه و همچنین سازگاری با تغییرات شرایط محیطی، نیازمند تنظیم دقیق بیان ژن است. برای هر یک از پاسخهای عوامل تغییر (القایی)، ژنهای پاسخدهنده اولیه و تاخیری میتوانند شناسایی شوند. ژنهای اولیه، ژنهایی هستند که به محرکهای القایی و نسبتا سریع (بین ۵ و ۱۵ دقیقه بعد از القا) پاسخ میدهند. به طور طبیعی، این ژنها به محصولات سایر ژنها نیاز دارند. برای به دست آوردن پاسخ بهینه، ژنها در سطوح مختلفی تنظیم میشوند. بسیاری از ژنهای اولیه عمدتا در سطح رونویسی تنظیم میشوند. تنظیم رونویسی در سطح DNAژنومی صورت میگیرد. تنظیم پس از رونویسی میتواند به عنوان یک سطح اضافی از تنظیم مورد نیاز برای افزایش انعطافپذیری و سرعت پاسخهایی دیده شود که فراتر از آن هستند که بهتنهایی از طریق تنظیم رونویسی کسب شوند. چنین تنظیمی عمدتا از طریق کنترل پایداریmRNA رخ میدهد. به علاوه، تنظیم بیان ژن میتواند در سطح ترجمهای یا پس از ترجمهای صورت گیرد. در مورد تنظیم ترجمهای، آغاز ترجمه معمولا تحت تاثیر قرار گرفته، در حالی که کنترل پس از ترجمهای برای پروتئولیز نشان داده شده است. تا به امروز چندین ژن از خانواده ژنومی شناسایی شدهاند که میزان بیان آنها نسبت به اکسین تغییر میکند. در بسیاری از موارد، این ژنها نه تنها به اکسین پاسخ میدهند بلکه به سایر عوامل القاکننده نیز پاسخ میدهند. از سوی دیگر، تغییر در بیان ژن اولیه ممکن است منجر به پاسخ فیزیولوژیکی، ایجاد اشکال در تفکیک بین تغییر در بیان ژن تاخیری ایجاد شده توسط اکسین و تغییر بیان ناشی از پاسخهای فیزیولوژیکی شود. چندین گروه از ژنهای حساس به اکسین شناسایی شدهاند و آنها به صورت مستقیم یا غیر مستقیم به اکسین پاسخ میدهند (Ogbourne and Antalis, 1998). در سالهای اخیر، پیشرفتهای قابلتوجهی در روشنساختن مسیر Signal transduction اکسین صورت گرفته است.
در یک مدل جدید، اکسین بیان ژن و در نتیجه برآیند رشد و نمو را توسط فراوانی پروتئینهای مهارکننده رونویسی خانواده AUX/IAA تحت تاثیر قرار میدهد. AUX/IAها گمان میرود که توسط هترودایمریزه کردن و در نتیجه تغییر فعالیت فاکتورهای پاسخدهی به اکسین (ARFs) رونویسی را تنظیم میکنند. مطالعات متعدد ژنتیکی و بیوشیمیایی نشان دادهاند که انواع پاسخهای اکسین توسط دو خانواده بزرگ پروتئین به نام پروتئینهای ARF و AUX/IAA تنظیم میشوند. ARF ها بهواسطه اتصال به عناصر پاسخدهی به اکسین حفاظتشده در پروموتورهای ژنهای تنظیم شده با اکسین از جمله کدکنندههای AUX/IAA رونویسی را تنظیم میکنند. بنابراین تعادل AUX/IAAها وARF ها یک نقطه کنترل کلیدی در سیگنالینگ اکسین بوده و این به خواص دینامیکی آنها برمیگردد. اکسین تعادل را با تحریک پروتئولیز به واسطه یوبیکوئیتین پروتئینهای AUX/IAA از طریق یوبیکوئیتین لیگاز SCFTIR1 تغییر میدهد و این فیدبک برای تنظیم رونویسی AUX/IAA میباشد. اهمیت این مکانیسم در آنالیزهای ژنتیکی مشهود است (Liscum and Reed, 2002).
شکل-۱-۱۲- شمایی از ترارسانی علامت (Signal transduction) و تنظیم رشد گیاه.
روشهای تجربی بیوشیمیایی، مولکولی و ژنتیکی شواهد اولیهای را نشان میدهند که هردوی پروتئینهای ARF و AUX/IAA به عنوان عوامل رونویسی در ژنهای اولیهی پاسخ به اکسین عمل میکنند. این اطلاعات نشان میدهد که میانکنش احتمالی بین ARFها و بین ARFها و AUX/IAA وجود دارد. همچنان که در بالا ذکر شد شواهدی وجود دارد که برخی از ARFها فعالکننده بوده و سایر ARFها مهارکنندهی ژنهای حساس به اکسین هستند. اطلاعات اضافی در مورد پروتئینهای AUX/IAA (به عنوان مثال، بیان بیش از حد پروتئینهای AUX/IAA در سیستمهای سنجش گذرا) دلالت بر این دارد که پروتئینهای AUX/IAA به عنوان مهارکننده ژنهای حساس به اکسین عمل میکنند (Hagen and (Guilfoyle, 2002.
هماکنون شواهد قوی وجود دارد که تنظیم بیان ژن اکسین تحتتاثیر سایر مسیرهای سیگنالی قرار میگیرد. این شواهد عمدتا از خصوصیات موتانتهای پاسخدهی به اکسین به دست آمده است و نشان میدهند که سیگنالینگ اکسین بهواسطه تخریب پروتئین از طریق مسیر پروتئازوم/ یوبی کوئیتین، فسفریلاسیون پروتئین، نور و سایر هورمونها تحتتاثیر قرار میگیرد (Hagen and Guilfoyle, 2002) .
در این پژوهش، سعی شده است اثر تنش خشکی روی بیان چندین ژن مهم دخیل در مسیر ترارسانی علامت بررسی شود.
شناسایی ژنهای جدید، آنالیز الگوهای بیانی آنها در پاسخ به این تنشها و ارزیابی اعمال بالقوه آنها در سازگاری با تنش، استراتژی مهندسی موثری برای بهبود تحمل محصولات به تنش به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر این، ارتباط بین فرایندهای زیستی گیاه در سطح فیزیولوژیک و ژنتیک نیز در این پژوهش مورد بحث قرار گرفته است.
.
فصل دوم :
مواد و روشها
۲-۱ شرایط رشد
برای رشد گیاهان از تکنیک کشت بافت (Tissue Culture) استفاده شد. بذرهای گیاه کلزا (B.napus) رقم اکاپی (Okapi) حساس به خشکی و رقم زرفام (Zarfam) مقاوم به خشکی از موسسهی تحقیقات اصلاح و تهیهی نهال و بذر کرج بخش دانههای روغنی تهیه گردید. ابتدا بذرها با استفاده از اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲ دقیقه و سپس با Bleach (هیپوکلریت سدیم) ۲۰ درصد به مدت ۱۰ دقیقه استریل و در نهایت ۴ بار با آب دیونیزه شستشو شدند. بذرهای استریل شده به محیط MS پایه (Murashige & skoog basal medium) نیممرتبه (half-strength) تهیه شده از شرکت سیگما آمریکا ((Sigma M5519 با ۸/۵ pH=حاوی ۸/۰ درصد آگار (Plant agar, Sigma) منتقل شده و سپس به مدت ۸ روز در اتاق رشد تحت شرایط ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد با شدت نور µmol/m2.s2000 قرار گرفتند.
شکل-۲-۱- تصویر گیاهچههای کلزا.
۲-۱-۱ نحوه تیماردهی گیاهان
گیاهچههای (Seedlings) 8 روزهی کلزا به مدت ۲۴ ساعت و در سه دوره زمانی در معرض تنش خشکی قرار گرفتند. در مطالعه حاضر، به منظور اعمال تنش خشکی، گیاهچهها تحت تیمار مانیتول (Mannitol) 200 میلیمولار قرار گرفته و به ۴ گروه تقسیم شدند:
گیاهان شاهد (Control): به این گروه مقدار ۴۰ میلی لیتر محلول MS (بدون آگار) در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل اضافه شده و سپس به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر (Shaker) قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۳ ساعت (۳h): این گیاهان به مدت ۳ ساعت به منظور اعمال تنش خشکی، تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۳ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۱۲ ساعت (۱۲h): این گروه به مدت ۱۲ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۱۲ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۲۴ ساعت (۲۴h): این گیاهان به مدت ۲۴ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این گروه، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی (CRD‌)[۴۱] با ۴ تیمار و هر تیمار در ۳ تکرار انجام گردید.
۲-۱-۲ برداشت نمونه
۲-۱-۲-۱ برداشت نمونه جهت انجام بررسیهای مولکولی
پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمانهای صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشههای حاوی گیاهچهها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچهها و آبگیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله در ازت مایع منجمد و در نهایت در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه نگهداری شدند.
۲-۱-۲-۲ برداشت نمونه جهت انجام بررسیهای فیزیولوژیک
نمونهبرداری از کل Seedling انجام گرفت. پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمانهای صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشههای حاوی گیاهچهها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچهها و آبگیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله به فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه انتقال داده شدند. جهت تعیین وزن خشک برای برخی آزمایشات که نیاز به وزن خشک نمونهها داشت، ریشهها و ساقهها در آون ۸۰ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت قرار گرفتند. وزن خشک با ترازویی با حساسیت ۰۰۰۱/۰ گرم اندازهگیری شد.
۲-۲ روشهای بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی

برای دانلود متن کامل این فایل به سایت torsa.ir مراجعه نمایید.