سایت مقالات فارسی – مطالعه تجربی و مدلسازی ریاضی خشک کن آنالیز بیان چندین ژن مهم …

۲-۲-۱ پودر کردن و آمادهسازی نمونه جهت استخراج RNA
نمونههای گیاهی در هاون حاوی نیتروژن مایع کوبیده شدند تا بخوبی پودر شوند. این عمل برای از بین بردن دیواره سلولی و غشای پلاسمایی نمونهها انجام میگیرد تا استخراج RNA کل آنها قابل انجام باشد. نمونههای پودر شده وارد لولههای Eppendorf 15 میلی لیتری شده و تا زمان انجام آزمایش در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. به این ترتیب دارای ۸ گروه نمونه پودر شده هستیم که شامل ۴ سری از رقم اکاپی و ۴ گروه از رقم زرفام میباشند.
۲-۲-۲ استخراج RNA از بافت گیاهی
حدود ۲۰۰ میلی گرم از بافت نمونه مورد نظر در۵۰۰ میکرو لیتر Trizol® داخل تیوب (tube) 5/2 میلی لیتر ریخته و مخلوط بخوبیvortex گردید. سپس ۵۰۰ میکرو لیتر دیگر Trizol® به آن اضافه و دوباره مخلوط را vortex کرده و بمدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شده و مخلوط به خوبی vortex گردید.
مخلوط حاصل به مدت ۱۵ دقیقه در دور g14000 در دمای cº۴ با دستگاه سانتریفوژ ساخت شرکت eppendorf آلمان سانتریفوژ شدند.
مایع شفاف بالایی توسط پیپت از رسوبات کف تیوب جدا شده و به تیوب دیگری انتقال یافت.
۵۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانول به آن اضافه شده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت.
محتوای تیوبها دور ریخته میشود و پلیتهای به جا مانده در کف تیوبها با ۱۵ میلی لیتر اتانول ۷۰% شسته شدند.
پس از آن تیوبها به مدت ۱ دقیقه در دمای cº۴ سانتریفوژ گشتند.
محتوای تیوب دور ریخته شده و طی ۵-۱۵ دقیقه اجازه خشک شدن به پلیتها داده شد.
پلیتها در ۴۰ میکرو لیتر DEPC ( H2O بدون RNase) انحلال یافتند.
بدین ترتیب RNA استخراج شده و برای سنجش میزان غلظت RNA و خلوص آن از دستگاه اسپکتروفتومتر ساخت شرکتEppendorf آلمان استفاده گردید.
۲-۲-۳ اندازهگیری میزان غلظت RNA و رقیقسازی نمونهها
غلظت RNA با دستگاه اسپکتروفتومتر برای هر نمونه اندازهگیری شد. بدین نحو که ۲ میکرو لیتر از نمونه RNA در ۱۹۸ میکرولیتر آب دیونیزه حل و غلظت توسط دستگاه خوانده شد. پس از هر بار استفاده با قرار دادن سل (Cuvette) حاوی آب مقطر دستگاه صفر گردید. اعداد بدست آمده از سنجش RNA برای رقیقسازی محلولها ضروری میباشد. بدین طریق تمام محلولها به یک میزان رقیق میشوند.
۲-۲-۴- روش تهیه cDNA
– قبل از انجام آزمایش محتویات کیت بخوبی تکان داده شده و مختصرا سانتریفوژ گردید.
۲- مواد مورد استفاده در آزمایش در یک تیوب مخصوص عاری از آنزیم نوکلئاز ریخته و بر روی یخ قرار داده شدند:
RNA ی الگو (Template) به میزان ۱ میکرو گرم
Oligo dT به میزان ۱ میکرو لیتر
آب DEPC نیز به مقداری که محتوی کل موجود در تیوب به مقدار ۱۲ میکرو لیتر برسد، به محتویات موجود در تیوب اضافه گردید.
اگر RNA الگو غنی از نوکلئوتیدهای سیتوزین و گوانین باشد یا دارای ساختاری ثانویه باشد، آنرا بخوبی تکان داده و سپس به میزان کمی آنرا سانتریفوژ کرده و در نهایت به مدت ۵ دقیقه در دمای cº۶۵ قرار داده میشوند.
جهت سنتز cDNA، از کیتsynthesis First strand cDNA ساخت شرکت Fermentas استفاده شد که محتوای:
۵X Reaction buffer به میزان ۴ میکرو لیتر
مهار کننده فعالیت آنزیم RNase به میزان ۱ میکرو لیتر
دزوکسی نوکلئوتید تریوز فسفات (dNTP) به میزان ۲ میکرو لیتر
آنزیم Reverse Transcriptase به میزان ۱ میکرو لیتر
تیوبها در دمای ۴۲ به مدت ۱ ساعت در دستگاه PCR ساخت شرکت Eppendorf آلمان قرار داده شدند تا cDNA سنتز شود. برای توالیهای غنی از GC دمای دستگاه را می توان تا cº۴۵ افزایش داد.
واکنش با حرارت دان مخلوط مورد نظر در دمای cº۷۰ به مدت ۵ دقیقه به پایان رسید.
۲-۲-۵- واکنش RT-PCR
PCR در ۲۵ میکرو لیتر محلول حاوی ۵/۱۲ میکرولیتر Mastermix، ۵/۰ میکرو مول از هر کدام از پرایمرها، ۱ میکرولیتر از cDNAو ۵/۱۰ میکرولیتر آب انجام پذیرفت.در این واکنش دناتوراسیون (Denaturation) ابتدایی در دمای cº۹۵ به مدت ۳ دقیقه شروع شده و با ۳۰-۲۸ چرخه (Cycle) از دورههای : cº۹۵ به مدت ۲۵ ثانیه، دمایannealing cº۶۰-۵۸ به مدت ۲۰ ثانیه و دمایextension cº۷۲ به مدت ۲۵ ثانیه ادامه یافت و نهایتا به مدت ۷ دقیقه در دمای cº۷۲ extension) نهایی) به پایان رسید.
۲-۲-۶ تهیه ژل الکتروفورز
بدین منظور ابتدا TBE 5X را تهیه کرده و پس از رقیق کردن آن به ۰٫۵X، آگارز به آن اضافه شد.
۲-۲-۶-۱ تهیه TBE 5X
۵۴ گرم تریس باز
۵/۲۷ گرم بوریک اسید
۲۰ میلی لیتر EDTA 5/0 مولار

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  pipaf.ir  مراجعه نمایید.