تحقیق – مطالعه تجربی و مدلسازی ریاضی خشک کن آنالیز بیان چندین ژن مهم در …

۲-۳ روشهای بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی
۲-۳-۱ طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیمهای آسکوربات و گایاکول پراکسیداز
برای تهیه عصاره گیاهی از روش (Kang and Saltiveit, 2002) با اندکی تغییرات استفاده شد. g5/0 وزن تر بافت از هر دو اندام ریشه و اندام هوایی بطور جداگانه از کلیه تیمارها توزین گردید و سپس به داخل هاون سرد منتقل شد و توسط ml 3 بافر شامل ( بافر تریس- HCl 05/0 مولار با PH 5/7 ، MgCl2 ۳ میلی مولار ، EDTA 1 میلی مولار) با دسته هاون خوب له شد. بافر استخراجی جهت اندازهگیری فعـــالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) شامل۲ میلی مولار آسکوربات نیز بود. هموژنات سپس به مدت ۲۰ دقیقه با نیروی g5000 سانتریفوژ شد. محلول رویی (Supernatant)
حاصله به عنوان عصاره خام برای اندازهگیری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان استفاده گردید.
۲-۳-۱-۱ اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX)
فعالیت آنزیم APX در تمام تیمارها و تکرارها با استفاده از روش and Azada, 1981) (Nakano، با اندکی تغییرات اندازهگیری شد. ml3 بافر فسفات ۵۰ میلی مولار با PH 7 شـامل (EDTA 1/0میلی مولار، آسکوربات سدیم ۵/۰ میلی مولار، ml 2/0 ‌H2O2 %۱ (w/v)) برداشته و روی آن ml 1/0 آنزیم استخراجی اضافه نموده سپس فعالیت آنزیم ازطریق اکسید شدن آسکوربات توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 290 اندازهگیری شد که همراه با کاهش جذب در طی یک دقیقه فعالیت آنزیم بود. برای سنجش میزان فعالیت از ضریب خاموشی (m M-1 cm-18/2) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۱-۲ اندازهگیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX)
فعالیت (GPX) در کلیه تیمارها و تکرارها با استفــاده از روش et al., ۱۹۸۵) (Upadhyayaانجام گرفت. مخلوط واکنش شامل ۵/۲ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷pH=)، ۱ میلی لیتر گایاکول ۱درصد، ۳/۰ میلی لیتر عصارهی آنزیمی بود. بعد از رسیدن به تعادل به مدت ۱ دقیقه در cº۳۰ ، واکنش با افزودن ۱میلی لیتر H2O2یک درصد شروع شد. فعالیت GPXبه صورت افزایش در جذب طی ۱ دقیقه در طول موج ۴۲۰ نانومتر محاسبه شد.برای سنجش میزان فعالیت آنزیم از ضریب خاموشی ( m M-1 cm-16/26) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۲ سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز
سنجش فعالیت آنزیم CAT با استفاده از روش (۱۹۸۴ Aebi,) انجام شد. مخلوط واکنش شامل ۳ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷pH=) محتوی ۲/۰ میلی لیتر H2O21درصد و lµ۵۰ عصارهی استخراجی بود. فعالیت آنزیم CAT به صورت کاهش در جذب H2O2 طی ۱ دقیقه در طول موج ۲۴۰ نانومتر محاسبه شد. یک واحد آنزیمی برای فعالیت کاتالاز به صورت مقدار آنزیم مورد نیاز برای اکسیده کردن Mµ ۱ H2O2در هر دقیقه تعریف میشود. برای سنجش میزان فعالیت از ضریب خاموشی ( mM-1 cm-10436/0) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۳ اندازهگیری میزان پراکسیداسیون چربیها (MDA)
برای اندازهگیری میزان پراکسیداسیون چربیها از روش (Heath and Packer, 1986)، استفاده گردید. ۱ گرم بافت تر توزین و توسط ml 5 محلول تریکلرواستیکاسید %۵ خوب له شده سپس محلول حاصله به مدت ۱۵ دقیقه با نیروی g 15000 سانتریفوژ شد. بعد از عمل سانتریفوژ، حجم مساوی از عصاره و تیوباربیوتیک اسید (%۵/۰در تریکلرو استیکاسید %۲۰) به داخل لوله آزمایش منتقل شده و به مدت ۲۵ دقیقه در بنماری cº۹۵ جوشانده شد. نهایتا لولهها را به مدت ۵ دقیقه وارد آب یخ نموده و بعد به مدت ۵ دقیقه در داخل سانتریفوژ با نیروی g 10000 گذاشته شد. میزان جذب محلول رویی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 532 سنجش شد و میزان جذب در nm 600 از آن کم شد. میزان MDA از ضریب خاموشی ( mM-1cm-1155 (و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
MDA (µmol/g FW)= [A532-A600/155] × ۱۰۰۰
۲-۳-۴ اندازهگیری پروتئین کل
برای تعیین پروتئین کل از روش فولن لوری۱۹۵۱) (Lowry et al., استفاده شد. برای تعیین پروتئین کل ۰۵/۰ گرم ماده خشک از ریشه و اندام هوایی نمونههای گیاهی توزین شد و بر روی آنها ml 5 بافر تریس اسید کلریدریک (pH= 8) ml) 50 تریس ۲/۰ نرمال، ۲/۱۷ گرم ساکارز و ۱/۰ گرم اسید آسکوربیک در آب حل شده و در نهایت حجم محلول با آب مقطر به ml 100رسانده شد) اضافه کرده و خوب بهم زده و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی شیکر گذاشته شد و سپس به مدت ۳۰ دقیقه با نیروی g 5000 سانتریفوژ گردید. فاز رویی حاوی پروتئین محلول است. بر روی عصارهی پروتئینی محلولهای A، B و C اضافه میشود:
معرفهای A ، B ، C را طبق فرمول زیر و به ترتیب زیر به عصارهی پروتئین اضافه گردید.
محلول A : ۲ گرم کربنات سدیم (Na2Co3)، ۴/۰ گرم NaOH ، ۰۲/۰ گرم نمک راشل (تارتارات سدیم، پتاسیم، H2O4، C4H4KNaO6) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.
محلولB : ۵/۰ گرم سولفات مس متبلور (۵H2O ،CuSO4) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.
محلول C : ۵۰ میلی لیتر محلول A با یک میلی لیتر محلول B بلافاصله قبل از مصرف با هم مخلوط شدند.
یک میلی لیتر از نمونه (فاز رویی) را با ۴ میلی لیتر از محلول C به خوبی مخلوط نموده و ۱۰ دقیقه به حال خود گذاشته تا کاملا حل گردد. بعدا ۵/۱ میلی لیتر از محلول رقیق شده فولین سیوکالتئو که قبلا به نسبت ۹:۱ با آب مقطر رقیق شده بود به آن افزوده و ۳۰ دقیقه در تاریکی قرار داده شدند. کمپلکس آبی رنگی ایجاد گردید. در نهایت جذب آن در طول موج nm660 به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین و با استفاده از منحنی استاندارد پروتئین ، میزان پروتئین برحسب (mg g-1 DW) محاسبه گردید. برای شاهد بجای نمونه از آب مقطر استفاده شده و مراحل فوق در مورد آن اعمال گردید. به دلیل بالا بودن شدت رنگ همه نمونهها به نسبت ۱:۱ با آب مقطر رقیق شدند.
۲-۳-۵ اندازهگیری قندهای محلول
میزان قندهای محلول به روش فنل سولفوریک ( حدادچی، ۱۳۶۵) و براساس هیدرولیز اسیدی قندهای محلول و ایجاد ترکیب فورفورال که با فنل یک کمپلکس رنگی تولید کرده، اندازهگیری شد. ۵/۰ گرم وزن تر گیاه از هر تیمار توزین شد و در داخل ml 5 آب مقطر به وسیله هاون خوب له گردید سپس با تنظیف صاف شده و از عصـــارهی گیاهی حاصله ml2 برداشته و به داخل یک لوله آزمــایش منتقل گردید، روی آن ml 1 فنل %۵ (w/v) ریخته و در نهایت روی هر کدام از لولهها ml 3 اسید سولفوریک %۹۸ اضافه گردید، لولهها به مدت ۱ ساعت به حال خود رهــا شدند تا رنگ ظاهر و تثبیت شود. برای شاهد بجای عصاره گیاهی از ml 2 آب مقطر استفاده گردیده و مراحل فوق در مورد آن نیز اجرا شد. بعد از ظهور رنگ میزان جذب در nm 485 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری و با استفاده از منحنی استاندارد قندهای محلول، میزان قند در ریشه و اندام هوایی گیاهان شاهد و تحت تیمار تعیین گردیده و در نهایت میزان قندهای محلول بر حسب (mg g-1 DW) محاسبه گردید.
۲-۴ آنالیزهای آماری
مقادیر میانگین در ۳ تکرار بدست آمد و انحراف معیار میانگینها محاسبه گردید. اختلاف میانگینها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (ONE WAY ANOVA) محاسبه شد. گروهبندی تیمارها در سطح احتمال %۵ (P˂۰٫۰۵) با آزمون چند دامنهای Tukey انجام شد. آنالیز آماری دادهها با استفاده از نرم افزار spss نسخه ۱۸ انجام شد و نمودارها نیز با استفاده از نرم افزار Excel سری ۲۰۱۰ رسم شدند.
فصل سوم:
نتایج
۳-۱ نتایج حاصل از بررسیهای انجام یافته در سطح مولکولی
۳-۱-۱ بررسی بیان ژن Protein Kinase تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)
در این مطالعه، در گیاهچههای (Seedlings) کلزا رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن پروتئینکیناز(PK) نسبت به کنترل (زمان صفر) بهطور معنیداری افزایش یافت. بهطوریکه بیان آن بعد از ۳ ساعت تغییر قابل توجهی نداشته، اما بهتدریج افزایش یافته و بیشترین میزان بیان را در ۱۲ ساعت نشان داد. با این حال در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن PK نسبت به زمان کنترل کاهش معنیداری داشته و در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد.
Control
۳h
۱۲h 12h
۲۴h

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  ۴۰y.ir  مراجعه نمایید.